D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
植物病原真菌 Colletotrichum coccodes 會導致危險的馬鈴薯和番茄疾病,稱為炭疽病和塊莖黑斑病。 在形態學上,它們通常難以與其他微生物引起的疾病區分開來; 在綠色番茄果實上,這種疾病可以是無症狀的,僅在成熟的紅色果實上表現出來。 為了快速準確地診斷病原體,提出了一種實時PCR檢測系統。 為了開發測試系統,在俄羅斯不同地區從馬鈴薯塊莖中分離出的 45 株 C. coccodes 菌株中測定了三磷酸甘油脫氫酶基因的核苷酸序列。
基於獲得的結果和對來自 GenBank 數據庫中可用的其他物種的相似序列的分析,設計了物種特異性引物和 C. coccodes 探針。 為了測試所創建的測試系統的特異性,PCR 使用從與番茄和馬鈴薯植物相關的 15 種不同寄生和腐生真菌(尖孢鐮刀菌、黃萎病菌、Phomopsis phaseoli、Alternaria alternata、Helminthosporium solani)的純培養物中分離的 DNA 進行, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides)。 Colletotrichum coccodes DNA 的存在是在 20-27 個閾值循環確定的,而其餘物種在 40 個循環後確定或未檢測到。 該測試系統可以可靠地檢測分析的 PCR 混合物中超過 0.01 ng/mm3 的 C. coccodes DNA 濃度。 使用開發的測試系統,調查了具有真菌病症狀的番茄葉子和沒有疾病外部症狀的馬鈴薯塊莖中是否存在 C. coccodes。 具有真菌感染症狀的葉子是從克拉斯諾達爾地區的兩個不同的塊莖塊中收集的 - 來自科斯特羅馬、莫斯科、卡盧加和下諾夫哥羅德地區的塊莖。 在克拉斯諾達爾地區,發現一片番茄葉含有 C. coccodes DNA; 在 Kostroma、Moscow、Kaluga 地區種植的 5 個塊莖樣本中檢測到明顯存在這種病原體的 DNA。
介紹
炭疽菌屬真菌是危險的植物病原體,會影響穀物、蔬菜、草本植物、多年生水果和漿果植物。 該屬普遍存在的物種之一,Colletotrichum coccodes (Wallr)。
休斯,是炭疽病和土豆和西紅柿黑斑病的病原體,引起茄屬植物的許多其他植物的疾病,包括。 雜草(迪拉德,1992 年)。 C. coccodes 感染所有地下植物部分、莖基部、葉子和果實(Andrivon 等,1998;Johnson,1994)。 受感染的馬鈴薯塊莖果皮上出現灰色斑點,邊緣模糊,孢子形成和微菌核的黑點清晰可見。 在儲存過程中,塊莖的果肉中可能會形成內容物變軟的潰瘍,即這種疾病進入炭疽病階段,然而,這是極其罕見的。
同時,炭疽病(帶有小黑點的皮膚潰瘍)的症狀在番茄果實上很典型。 在葉子上,C. coccodes 的症狀表現為深褐色斑點,通常以黃色組織為界(Johnson,1994)。
塊莖上黑斑的發展破壞了它們的外觀,這在銷售水洗紅皮土豆時尤其明顯。 表皮脫層會導致過度蒸發和增加儲存損失(Hunger 和 McIntyre,1979 年)。 其他植物器官的感染會導致產量損失,這在開放和受保護的地麵條件下都已註意到(Johnson,1994;Tsror 等,1999)。 由 C. coccodes 引起的疾病在世界上幾乎所有馬鈴薯產區都很常見,包括俄羅斯(Leesa 和 Hilton,2003;Belov 等,2018)。 由於現有殺真菌劑對球蚴的有效性不足以及缺乏抗性品種,這些疾病的控制很困難(Read and Hide, 1995)。
C. coccodes 的接種物可以保存在塊莖中(Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997),番茄種子(Ben-Daniel et al., 2010)在土壤中存活很長時間,植物碎片(Dillard,1990 年;Dillard 和 Cobb,1993 年)和雜草中(Raid 和 Pennypacker,1987 年)。 許多作者的著作(Read and Hide, 1988; Barkdoll and Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard and Cobb, 1993)表明,馬鈴薯和西紅柿的疾病發展很大程度上取決於存在種子材料和土壤中的接種量。 因此,為了最大限度地減少疾病造成的損失,有必要對種子材料、土壤、馬鈴薯種子塊莖和儲存的番茄種子中的真菌繁殖體進行診斷(包括定量)。 土壤和植物材料的形態學診斷只能通過存在微菌核來進行,然而,在其他真菌物種中也發現了這種菌核。
塊莖症狀與由真菌 Helminthosporium solani 引起的銀痂非常相似。 將 Coccodes 和 Helminthosporium solani 分離到純培養物中是相當困難的,並且由於在營養培養基上生長緩慢而需要很長時間。 為了快速識別炭疽菌,有必要使用儀器診斷方法。 最方便的方法是聚合酶鍊式反應 (PCR) 及其修飾 - 實時 PCR。 目前,英國研究人員(Cullen 等,2002)針對 rDNA 的 ITS1 區域開發的測試系統在歐洲和美國使用。 它的使用在俄羅斯分離株的分析中也顯示出良好的結果(Belov 等人,2018 年)。 然而,C. coccodes 是高度可變的,它從單個 DNA 序列中檢測會導致假陰性結果。 為了提高診斷的可靠性,有必要對幾個物種特異性 DNA 序列進行分析,與此相關,我們開發了一個原始測試系統,使我們能夠通過 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的序列識別 C. coccodes。
材料和方法
為了評估所創建的測試系統的效率和特異性,作者從受影響的番茄葉和果實樣本中分離出 15 種真菌的純培養物,使用馬鈴薯塊莖(表 1)。 採集有真菌感染症狀的植物器官進行隔離,每株不超過一個器官。
將帶皮的塊莖切片、番茄果實切片和患葉置於雙目顯微鏡下,然後將菌絲體、孢子或組織片轉移到瓊脂培養基(麥芽汁-瓊脂)中用鋒利的解剖針放入培養皿中。 將分離物儲存在 4°C 試管中的傾斜瓊脂培養基上。
將在收集後(在田間)立即用於分析真菌病害症狀的番茄葉樣品置於 70% 乙醇中,並在其中儲存直至分離 DNA。 馬鈴薯塊莖被送到實驗室,它們被去皮(一塊 2 × 1 cm)並在 –20°C 下冷凍。 冷凍保存直至 DNA 分離。
用於 DNA 分離的純真菌培養物在液體豌豆培養基中生長。 從液體培養基中取出真菌的菌絲體,在濾紙上乾燥,在液氮中冷凍,勻漿,在 CTAB 緩衝液中培養,用氯仿純化,用異丙醇和 0.5 M 乙酸鉀的混合物沉澱,用 2 % 酒精。 將所得 DNA 溶解在去離子水中並儲存在 –70°С(Kutuzova 等人,20 年)。 使用 HS DNA 定量試劑盒在 Qubit 2017 (Qiagen, Germany) 上測量 DNA 濃度。 將酒精化和冷凍的樣品在液氮中研磨,然後如上所述進行 DNA 提取(用於純真菌培養物的菌絲體)。
表 1. 工作中使用的真菌菌株的來源
蘑菇名稱 | 植物,器官 | 選擇地點 |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, 立枯絲核菌 | 馬鈴薯塊莖 | 科斯特羅馬地區,第一代馬鈴薯塊莖,紅斯嘉麗品種 |
炭疽菌 4 | 馬鈴薯葉 | 眾議員。 瑪麗埃爾,約什卡爾-奧拉 |
茄病長絲孢黴 | 馬鈴薯塊莖 | 馬加丹地區,pos。 帳篷,馬鈴薯塊莖 |
富葉枝孢 | 番茄葉 | 莫斯科地區,大果番茄 |
嗜番茄鍊格孢 | 番茄果實 | 由全俄植物保護研究所真菌學和植物病理學實驗室工作人員移交 |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | 番茄果實 | 克拉斯諾達爾地區,克里米亞地區,斯利夫卡品種 |
尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) | 小麥根 | 莫斯科地區 |
PCR 在 DTprime 放大器(DNA-Technology)上進行。 用於三磷酸甘油脫氫酶基因物種特異性區域的原始引物和探針用於PCR:Coc70gdf正向引物,TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA;Coc280gdr反向引物,TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA; 引物擴增 1 bp 區域。
將 50 ng 總 DNA(在分析葉子和塊莖時)和 10 ng(當分析純真菌培養物的 DNA 時)加入反應中。 通過石蠟層將反應混合物 (35 µl) 分成兩部分:下部 (20 µl) 含有 2 µl 10× 反應緩衝液 (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2;0.1% Tween-20)、0.5 mM 每種脫氧核苷酸三磷酸、7 pmol 每種引物和 4 pmol 可水解熒光探針; 最上面的一個包含 1 µl 10x PCR 緩衝液和 1 U Taq 聚合酶。
混合物與石蠟的分離使得管子可以在 5°C 下長時間儲存,並在 10°C 以上的溫度下加熱 80 分鐘後為 PCR 提供熱啟動。 根據以下程序進行PCR:94.0°C,90 s(1個循環); 94.0°C – 30 秒; 64.0°C – 15 秒(5 個循環); 94.0°C – 10 秒; 64.0°C – 15 秒(45 個循環); 10.0°C - 儲存。
結果與討論
從俄羅斯不同地區的馬鈴薯葉、莖、塊莖和番茄果實(Kutuzova,45)中分離出的 2018 株菌株中測定了三磷酸甘油脫氫酶基因的序列。 所有菌株的研究序列分為兩個核苷酸不同的兩組。 兩組代表的核苷酸序列以編號 KY2 和 KY496634 保存在 GenBank 中。
基於 coc70gdf、coc280gdr 和探針 cocgdz 設計的引物使用 BLAST 程序進行測試(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 在 GenBank 數據庫中可用的炭疽菌屬物種和其他生物的所有三磷酸甘油脫氫酶基因序列上。
未發現與引物和探針高度同源的其他生物的DNA區域。
使用具有不同濃度的 C. coccodes DNA、受炭疽病影響的馬鈴薯葉 DNA(2017 年在 Mari El,cv. Red Scarlett 收集)和受黑斑病影響的塊莖果皮(收集在科斯特羅馬地區,栽培品種 Red Scarlett,表 2)。 為了確認塊莖和馬鈴薯葉中 DNA 的存在,將 C. coccodes 菌株從它們中分離到純培養物中。
該測試系統的敏感性分析結果表明,如果PCR混合物中的總含量大於0.05 ng,則可以成功診斷樣品中C. coccodes DNA的存在。 這對於檢測來說已經足夠了,因為一個菌核平均含有 0.131 ng,一個孢子平均含有大約 0.04 ng DNA(Cullen 等,2002)。 由英國小組(Cullen 等,2002)開發的測試系統顯示出相似的靈敏度(34 ng DNA 時的閾值循環 0.05 和 37 ng 時的 0.005)。
在所有情況下對含有 C. coccodes 的天然樣品的分析使得可靠地揭示其在樣品中的存在成為可能(表 2)。 所提出的 DNA 提取方法也證明適用於天然植物樣品的分析。
表 2. 確定用於實時 PCR 的 Colletotrichum coccodes 鑑定所提出的測試系統的靈敏度
Образец | 樣本中的 DNA 量*,ng | 閾值循環 | 檢測 C. coccodes |
---|---|---|---|
炭疽菌絲體 | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
塊莖皮 1 | 50 | 32 | + |
塊莖皮 2 | 50 | 30 | + |
塊莖皮 3 | 50 | 31.5 | + |
馬鈴薯葉 | 50 | 29.5 | + |
筆記。 *在 PCR 產物的混合物中。
測試系統的特異性在從 15 種真菌中提取的 DNA 樣本上進行了測試。 作者從番茄、馬鈴薯塊莖的受影響和健康果實和葉子中分離出所有真菌菌株; 從小麥根中分離出一株(表 1)。 在從果實表面分離的物種中,還有一些對番茄沒有致病性的物種(例如,桑黃)。
研究表明,C. coccodes DNA 在 20-27 個閾值循環時被檢測到,而其他真菌物種在第 40 個循環後未檢測到或發出信號,這可歸因於非特異性噪聲效應(表 3)。
表 3 不同菌種的檢測系統檢查
蘑菇名稱 | 閾值循環 |
炭疽菌 1 | 20.9 |
C. 椰子 2 | 22.6 |
C. 椰子 3 | 23 |
C. 椰子 4 | 22 |
尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
茄子枯萎病 | > 40 |
菜豆 | > 40 |
交鍊格孢 | > 40 |
A.番茄 | > 40 |
茄病長絲孢黴 | > 40 |
桑黃 | > 40 |
葡萄乾 | > 40 |
稗草 | > 40 |
枝孢菌 | > 40 |
黃黴 | > 40 |
長齒甲齒龍 | > 40 |
青黴 SP。 | > 40 |
筆記。 *所有樣本中的 DNA 量均為 10 ng。
所開發的測試系統用於鑑定番茄葉片樣本中的 C. coccodes,這些樣本中有壞死性病原體和種薯塊莖的損害症狀,但沒有明顯的症狀。 在這項研究中,採集了在科斯特羅馬、莫斯科、卡盧加、下諾夫哥羅德地區種植的不同品種的塊莖。 C. coccodes DNA 在樣品中的存在被認為是顯著的,在分析中,閾值循環不超過 35。這個閾值的選擇基於可靠地確定 0.05 ng 的 C. coccodes DNA(循環閾值 33.5,表 2)以及當閾值循環高於 40 時,診斷出一些其他真菌物種的非特異性 DNA 的事實。 使用這種方法,在科斯特羅馬、莫斯科和卡盧加地區種植的 5 個塊莖樣本和克拉斯諾達爾地區葉伊斯克地區的一片番茄葉中檢測到顯著存在 C. coccodes DNA(表 4、5)。
表 4. 馬鈴薯塊莖炭疽菌的檢測*
樣品編號 | 各種土豆 | 增長的地方 | 檢測 C. coccodes | 閾值循環 |
---|---|---|---|---|
1 | 紅猩紅 | 科斯特羅馬地區 | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | 桑特 | 莫斯科地區 | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | 茹科夫斯基早期 | 莫斯科地區 | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | 莫莉 | 卡盧加地區 | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | 幻想 | 卡盧加地區 | - | |
15 | 節日 | 下諾夫哥羅德地區。 | - | |
16 | - |
筆記。 *所有樣本中的 DNA 量均為 50 ng。
表 5. 番茄葉上炭疽菌的檢測*
樣品編號 | 增長的地方 | 檢測 C. coccodes | 閾值循環 |
---|---|---|---|
1 | 克拉斯諾達爾地區,克里米亞地區 | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | 克拉斯諾達爾邊疆區,耶斯克區 | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*所有樣本中的 DNA 量為 50 ng。
我們創建的測試系統在靈敏度和特異性方面不遜於英國研究人員(Cullen et al., 2002)開發的系統,適用於植物樣本的分析。 它用於種子塊莖的分析使得可以檢測塊莖中的 C. coccodes DNA 而沒有外部損傷跡象,並成功地分析葉子的感染。
迄今為止,俄羅斯尚未對馬鈴薯塊莖感染 C. coccodes 進行過分析。 我們的第一項研究表明,在俄羅斯聯邦不同地區種植的 16 個經過測試的塊莖中,有 5 個含有 C. coccodes。 這說明馬鈴薯塊莖黑斑病是俄羅斯常見的馬鈴薯病害,其對馬鈴薯作物減產和減產的作用被低估了。
在分析番茄葉子時,在克拉斯諾達爾地區葉斯克區的一片葉子中檢測到顯著存在 C. coccodes DNA。 此前,當使用英國測試系統檢查俄羅斯南部的番茄田時(Cullen 等,2002),檢測到含有 C. coccodes 的葉子,並且在一些田地中發現了高比例的受 C. coccodes 影響的葉子(Belov 等等人,2018)。 在莫斯科地區的克拉斯諾達爾和濱海邊疆區,我們發現了番茄果實,我們設法從中分離出純種 C. coccodes。 C. coccodes 在俄羅斯的番茄上的傳播範圍可能比目前認為的要廣泛得多,而且它的危害性也被低估了。
因此,迄今為止,關於 C. coccodes 在馬鈴薯和西紅柿上的廣泛分佈已經積累了足夠的信息。
為了更好地了解這種真菌在馬鈴薯和番茄病害發展中的作用,有必要廣泛監測其在俄羅斯的流行情況,研究土壤和種子感染的作用,以及黑斑病在儲存損失中的作用。 使用 PCR 診斷可以顯著促進這項工作,同時使用兩種測試系統將顯著提高分析的準確性。
這項工作得到了 RSF 贈款號 18-76-00009 的支持。
該文章發表在《真菌學與植物病理學》雜誌(54 年第 1 卷第 2020 期)上。