吃。 丘迪諾夫普拉托諾夫(A.V.) S.N.亞歷山德羅娃伊蘭斯基
最近顯示,子囊真菌伊蘭氏菌能夠感染馬鈴薯塊莖。 這項工作是首次分析從馬鈴薯中分離出的I. crassa菌株的生物學特性和對某些殺真菌劑的抗性。 “馬鈴薯”菌株的物種特異性區域序列與早先從黃水仙,人參,白楊和山毛櫸,百合鱗莖和郁金香葉的根中分離出的真菌獲得的序列一致。 顯然,許多野生和園林植物都可以作為crassa的儲備。 被調查的菌株感染了番茄和馬鈴薯切片,但沒有感染整個番茄果實和完整的馬鈴薯塊莖。 這表明I. crassa是傷口寄生蟲。 在營養培養基上對氟狄莫尼,二苯並康唑和嘧菌酯的抗性評估表明這些藥物具有很高的功效。
EC50指數(殺真菌劑的濃度,相對於殺真菌劑的控制,其濃度降低了菌落徑向生長速率的2倍)等於0.4; 分別為7.4和4 mg / l。 在馬鈴薯塊莖的植物病理學評估和植物保護措施的製定中,應考慮到由克雷薩酵母引起的病害發展的可能性。
植物致病微生物的發展導致馬鈴薯種植和貯藏各個階段的大量損失。 通常,在製定保護措施時,要考慮到著名的病原體,例如鍊格孢屬,鐮刀菌,番茄,蠕蟲,炭疽菌,疫黴菌等。然而,近年來,關於馬鈴薯上新的植物病原微生物的出現越來越多的報導。 它們的生物學研究很差,與馬鈴薯相關的殺菌劑的功效尚不清楚,診斷方法尚未開發。 隨著大規模發展,它們能夠對馬鈴薯作物造成重大損害。 這些微生物中的一種是子囊菌真菌Ilyonectria crassa(Wollenw.A.Cabral&Crous),這是作者首先在馬鈴薯塊莖上發現的(Chudinova等,2019)。
這項工作介紹了從馬鈴薯塊莖中分離出的I. crassa菌株的分析結果。 研究了Crassa I.菌群的菌落和菌絲體結構,物種特異性DNA區域的核苷酸序列,對土豆和西紅柿的毒力以及對某些流行的殺菌劑的抗性。
材料和方法
我們使用了18年從在Kostroma地區種植的受感染馬鈴薯塊莖中分離出的I. crassa 2KSuPT2018菌株。 塊莖受干腐病的影響,其空腔覆蓋著淺棕色菌絲體。 用無菌解剖針將真菌菌絲體轉移到帶有瓊脂培養基(啤酒麥芽汁10%,瓊脂1.5%,青黴素1000 U / ml)的培養皿中。 將平板在黑暗中於24°C孵育。
使用帶ICC2500 HD數碼相機的Leica DM50光學顯微鏡和帶IC80HD數碼相機的Leica M80雙目顯微鏡(德國Leica Microsystems)拍攝,評估孢子和孢子器官的大小和形態。
為了分離DNA,將真菌菌絲體在豌豆培養基中生長,然後在液氮中冷凍,勻漿,在CTAB緩衝液中孵育,用氯仿純化,並用2%酒精洗滌兩次。
DNA提取方法在Kutuzova等人的文章中有詳細描述。 (2017)。
為了通過分子方法確定物種並與其他已知的克雷薩酵母菌株進行比較,使用允許擴增物種特異性DNA區域的引物進行PCR:ITS1-5,8S-ITS2(引物ITS5 / ITS4,White等,1990),基因區域b -微管蛋白(Bt2a / Bt2b,Glass,Donaldson,1995)和翻譯延伸因子1α(tef1α)(引物EF1-728F / EF1-986R,Carbone和Kohn,1999)。 使用Evrogen CleanUp試劑盒從凝膠中提取所需長度的擴增子。 使用終止子v3.1循環測序試劑盒(Applied Biosystems,CA,美國)在Applied Biosystems 3730x6自動測序儀(Applied Biosystems,CA,美國)上對擴增的區域進行測序。 所得核苷酸序列用於在美國國家生物技術信息中心(NCBI)的GenBank數據庫中搜索匹配項。 系統發育分析是使用MEGA 2013程序進行的(Tamura等,XNUMX)。
對大果番茄(Dubrava品種)和馬鈴薯塊莖(Gala品種)的整個綠色水果進行了毒力測定。 另外,為了模擬損壞的水果和塊莖的損壞,我們使用了相同水果和塊莖的切片。 將塊莖切成片放在潮濕的小室內,這是皮氏培養皿,底部有濕濾紙。 將幻燈片放在紙上,然後在其上放置片狀的塊莖或水果。 整個塊莖和水果也被放在底部裝有濕濾紙的容器中。 在麥汁瓊脂上生長5天后,在切片的中心(或塊莖或水果的完整表面上)放置一塊帶有真菌菌絲的瓊脂(5×5 mm)。
真菌菌株對殺真菌劑的抗性評估是在實驗室條件下在瓊脂營養培養基上進行的。 我們研究了對殺菌劑Maxim,KS(活性成分氟地西尼,25 g / l),Quadris,KS(嘧菌酯250 g / l),Scor,EC(二苯甲康唑250 g / l)的敏感性(國家目錄...,2020)。 在麥芽汁瓊脂培養基上的陪替氏培養皿中進行評估,並添加所研究藥物的活性物質濃度為0.1; 一; 1 ppm(mg / L)(對於氟地西尼和二氟康唑),10; 十; 1 ppm(對於嘧菌酯),在無殺菌劑的培養基中(對照)。 將殺真菌劑添加到熔化並冷卻至10°C的培養基中,然後將培養基倒入陪替氏培養皿中。 將帶有真菌菌絲體的瓊脂塊置於培養皿的中央,並在黑暗中於100°C的溫度下培養。 溫育60天后,在兩個相互垂直的方向上測量菌落的直徑。 平均每個菌落的測量結果。 實驗一式三份進行。 根據分析結果,計算出EC24,等於殺真菌劑的濃度,相對於殺真菌劑控制,其使菌落的徑向生長速度減半。
結果與討論
在帶有麥芽汁瓊脂的皮氏培養皿上,真菌形成帶有白色絮狀菌絲體的菌落。 菌絲體下的培養基變成紅棕色。 當培養基變乾時,真菌在小孢子蟲中的單個和聚集分生孢子上形成兩種類型的孢子。 大分生孢子是細長的圓柱形,間隔為一到三個,平均長度為27.2 µm,取值範圍為23.2至32.2 µm,寬度-最高4.9 µm(圖1)。 微分生孢子的平均長度為14.3μm,取值範圍為10.3至18.1μm,寬度最大為4.0μm。 所有宏觀和微觀形態特徵都適合克氏伊氏菌屬物種的變異範圍(Cabral等,2012)。
物種特異性DNA區域(ITS,b-微管蛋白,TEF1α)的序列與我們之前研究的I. crassa菌株的序列完全一致(Chudinova et al。,2019,Table 1)。 為了研究在其他地區的I. crassa患病率並分析受影響的培養物的譜,分析了GenBank數據庫中的類似DNA序列(表1)。 重疊率為86%至100%。 “馬鈴薯” crassa菌株的所有三個DNA區域的序列與從荷蘭的百合鱗莖和水仙的根以及加拿大的人參根分離的菌株的序列相同。 我們無法在開放數據庫中找到其他具有三個分析相似序列的克雷薩酵母。 然而,對沉積的ITS和β-微管蛋白序列的分析表明,英國的鬱金香葉片上存在I. crassa。 在分析加拿大的白楊根和意大利的山毛櫸根,沙特阿拉伯的馬鈴薯塊莖時,鑑定出具有相似ITS序列的真菌(表1)。 這項研究的結果表明,cr。crassa具有全球分佈,能夠感染各種植物。
在第5天確定番茄和馬鈴薯切片的致病性時,病變直徑達到1.5 cm,所研究的菌株未感染整個番茄果實和完整的馬鈴薯塊莖。 但是,萼片在番茄上受到影響。 為了排除污染的可能性,將馬鈴薯塊莖切片上形成的菌絲體的真菌分離物分離為純培養物。 它與親本菌株完全相同。 顯然,I。crassa是傷口寄生蟲。
播種前用殺菌劑處理可減少植物在生長季節疾病的發展。 為了選擇有效的殺菌劑,重要的是要評估其中哪些對伊拉沙酵母有效。 這項工作研究了廣泛的殺菌劑活性物質-氟地索尼,嘧菌酯,苯乙康唑。 氟迪沙尼包含在種植前用於拌種種子和塊莖的幾種混合物中。 儲液前,氟二噁唑(Maxim)也可用於處理塊莖。 Difenoconazole和azoxystrobin也包括在許多用於處理種子材料的製劑中,以及旨在用於處理植物性植物的製劑中(國家目錄...,2020)。
在具有不同濃度的活性物質的培養基(圖2)上研究了克氏梭菌的生長速率:氟地西尼(EC50 = 0.4 ppm),嘧菌酯(EC50 = 4 ppm)和二苯並康唑(EC50 = 7.4 ppm)(表2)。 這些製劑被認為對克雷薩氏菌非常有效,因為它們的EC50明顯低於用於治療塊莖的工作液中推薦的製劑濃度。 根據國家目錄...(2020年),用於治療馬鈴薯塊莖的液體中氟地西尼的濃度為500至1000 ppm,嘧菌酯(用於治療犁bottom底部的液體中)-3750-9375 ppm,敵苯康康唑(用於治療植物性植物的液體中)-187.5– 625 ppm。
表1. Genbank數據庫中可用的菌株18KSuPT2的物種特異性序列與克雷耶菌的序列的相似性
應變 | 寄主植物,排泄場所 | GenBank中保存的序列號,相似性百分比 | 鏈接 | ||
ITS | β微管蛋白 | TEF1α | |||
17KSPT1和18KSuPT2 | 科斯特羅馬地區馬鈴薯塊莖 | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al。,2019,這項工作 |
哥倫比亞廣播公司 158/31 | 水仙根,荷蘭 | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral等,2012 |
哥倫比亞廣播公司 139/30 | 荷蘭百合燈泡 | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | 加拿大人參根 | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
右方235138 | 英國鬱金香葉 | KJ475469 100 | KJ513266 100 | 釹 | 丹頓,丹頓,2014 |
MT294410 | 加拿大阿斯彭根 | MT294410 100 | 釹 | 釹 | 拉姆斯菲爾德(Ramsfield)等人,2020年 |
ER1937 | 意大利比奇 | KR019363 99.65 | 釹 | 釹 | 提扎尼,海吉,莫塔。 直接提交 |
考夫19 | 馬鈴薯塊莖,沙特阿拉伯 | HE649390 98.3 | 釹 | 釹 | 蓋爾巴里(Gherbawy),2013年 |
ND =未存入
表2.毛伊蘭菌對殺真菌劑的抗性
(活性物質) | EC50,ppm | ||||
3天 | 5天 | 7天 | |||
控制 | 17± 2 | 33± 5 | 47± 3 | ||
堪薩斯州Quadris(fsoxystrobin) | 18± 1 | 34± 2 | 48± 2 | ||
11± 1 | 11± 1 | 12± 1 | |||
11± 1 | 11± 1 | 12± 1 | |||
堪薩斯州馬克西姆(氟地西尼) | 16± 1 | 28± 2 | 48± 2 | ||
7± 1 | 13± 3 | 19± 4 | |||
5± 1 | 12± 1 | 17± 5 | |||
EC Skor(二苯甲康唑) | 18± 1 | 35± 2 | 48± 1 | ||
11± 1 | 24± 3 | 35± 4 | |||
11± 1 | 13± 1 | 17± 3 |
在我們的工作中,從科斯特羅馬和莫斯科(Chudinova等人,2019)地區的馬鈴薯塊莖中分離出克雷薩菌。 在分析沙特阿拉伯馬鈴薯塊莖的真菌菌群時,發現了具有與ITS相同的ITS序列的高比例真菌菌株(Gashgari和Gherbawy,2013)。 顯然,Crassa I.在馬鈴薯上並不罕見。 我們的實驗表明,真菌可以感染受損的番茄果實。 從文獻中知道,crassa能夠腐生在土壤中腐生(Moll等人,2016),並能影響多種植物,甚至是在分類學上相距甚遠的植物,例如水仙花,百合,人參,白楊和山毛櫸(表1)。一)。 顯然,許多野生和園林植物都可以作為crassa的儲備。 以上表明,在製定保護措施時,有必要考慮到用這種真菌影響馬鈴薯塊莖的可能性。 用於治療馬鈴薯塊莖的廣泛製劑,其中含有氟地西尼,嘧菌酯和二苯並康唑,對I. crassa具有很高的殺菌作用。
這項工作得到了俄羅斯基礎研究基金會(授權號20-016-00139)的支持。
該文章發表在《植物保護公報》上,2020,103(3)