序號於蘭斯基N.V. Kokaeva Yu.T. Statsyuk 賈科夫
介紹
致病疫黴(晚疫病)是晚疫病的病原體,是馬鈴薯和番茄中最重要的經濟疾病,在過去半個多世紀的時間裡,它引起了各國研究人員的密切關注。 在XNUMX世紀中葉突然出現在歐洲,它引起了馬鈴薯流行病,至今仍在世人記憶中。
到現在為止,它通常被稱為“愛爾蘭飢餓的蘑菇”。 首次流行後近一百年,人們發現了抗晚疫病的野生墨西哥馬鈴薯,開發了將其與栽培馬鈴薯雜交的方法(Muller,1935),並獲得了第一個晚疫病抗性品種(Pushkarev,1937)。 然而,在其商業化種植開始後不久,對抗性品種具有毒性的晚疫病病原體的種族就聚集了。 並且從野生墨西哥馬鈴薯中引入新的抗性基因進入品種開始迅速失去效力。
使用單基因(垂直)抗性的失敗迫使育種者尋找利用非特異性多基因(水平)抗性的更複雜方法。 近年來,極具侵略性的種族已開始在寄生蟲的個體中積累,甚至導致非特異性抗性的侵蝕。 抗殺真菌劑菌株的出現在馬鈴薯保護化學品的使用中引起了問題。
由於卵菌和真菌在化學組成,超微結構和新陳代謝方面存在顯著差異,因此殺菌劑,特別是用於保護植物免受多種真菌病害侵害的系統性殺菌劑,對卵菌無效。
因此,在抗晚疫病的化學保護中,使用了多次(每季最多12次或更多次)噴灑具有廣泛作用的接觸製劑。 革命性的步驟是使用對酰胺類有毒並在植物中全身擴散的苯酰胺。 但是,它們的廣泛使用很快導致抗性菌株在真菌種群中的積累(Davidse等,1981),這大大增加了植物保護的難度。 致病疫黴實際上是溫帶地區的唯一寄生蟲,如果不使用化學保護手段,則無法消除有機農業中的危害(Van Bruggen,1995)。
以上解釋了來自不同國家的研究人員對致病疫黴種群的研究,其豐度動態和遺傳組成以及變異的遺傳機制的高度重視。
R. INFESTANS的生命週期
馬鈴薯晚疫病菌(Oomycete Phytophthora infestans)會在馬鈴薯葉片內部形成帶有菌絲體的細胞間菌絲體。 以葉組織為食,會導致形成黑斑,在潮濕的天氣中黑斑會變黑並腐爛。 在失敗之後,整個葉子都死了。 經過一段時間的攝食後,菌絲體上的生長產物-孢子囊-通過氣孔向外生長。 在潮濕的天氣中,它們在葉子下面的斑點周圍形成白色的花朵。 在孢子囊的末端,形成了檸檬形的動物孢子囊,該孢子囊破裂並被雨水帶走(圖1)。 落在馬鈴薯葉表面的水滴中,孢子囊萌發了6-8個游動孢子,經過一段時間的運動後,被倒圓,用殼覆蓋並用發芽管發芽。 芽苗通過氣孔進入葉片組織。 在某些條件下,孢子囊可以在生長管中直接生長到葉片組織中。 在有利的條件下,從感染到形成新孢子的時間僅為3-4天。
孢子囊一旦進入地面並通過土壤過濾,便能夠感染塊莖。 儲藏期間受嚴重影響的塊莖腐爛; 在受影響較弱的地區,感染可能會持續到下一個季節。 此外,晚疫病的病原體可以在冬季以卵菌(厚壁的靜止性孢子)形式存在於植物殘骸和番茄種子上的土壤中。 當不同交配類型的菌株遇到過多的水分時,在活的植物器官上會形成孢子。 在春季,無性孢子形成在種植的受感染塊莖和帶有卵孢子的植物殘渣上;游動孢子進入土壤並引起植物下部葉片的感染。 在某些情況下,菌絲體可以從被感染的塊莖沿著植物的綠色部分生長,通常出現在莖的上部。
卵菌類和大多數真菌之間的顯著差異在於其生命週期中雙相期的優勢,即配子減數分裂和合子(卵孢子)發芽而沒有還原性核裂變。 這一特徵加上偶極異性戀取代雙性戀,似乎有可能將卵白細胞應用於研究高級真核生物群體的方法(全混蟲症分析和群體細分,種群內和種群間基因流動等)。 但是,在研究感染疫病菌種群時,三個因素不允許完全轉移這些方法。
1.與雜交卵子一起,在種群中形成了自育和孤雌性卵子(Fife和Shaw,1992; Anikina等,1997a; Savenkova,Cherepnikoba-Anirina,2002; Smirnov,2003),其形成的頻率可能足以影響在測試結果上。
2.感染致病疫霉的有性過程對種群大小的動態影響不大,因為真菌主要通過營養孢子繁殖,佔傳統方法在營養培養基上交配類型分析結果的90%以上。 ... 生長季節是幾代無性孢子形成(多環疾病的發展)。 在沒有綠色植物的時期(冬季)和在幼苗的初次感染中,孢子在有機體的保存中起著重要作用。 然後,在夏季,發生剋隆繁殖,並且由於有性重組而導致單個克隆數目的增加或相反的減少,這主要是由選擇更適應的人決定的。 因此,附生開始和結束時種群中單個克隆的比例可以完全不同。
3.所描述的周期是其家鄉中美洲的致病疫黴原生種群的特徵。 在世界其他地區,有100多年的歷史,其性過程尚不為人所知;被感染的馬鈴薯塊莖中的營養菌絲體處於越冬階段。 生命週期是完全混亂的,並且傳播是自然界的焦點:單個被感染的塊莖的感染傳播到葉片,形成了該病的主要病灶,在病害大規模發展期間可能會合併。
因此,在某些地區,性和無性循環可能會交替,而在其他地區,只有性循環。
P. INFESTANS的起源
P. infestans於1991世紀上半葉出現在歐洲。 由於馬鈴薯原產於南美東北部,因此可以認為,該寄生蟲是在智利硝石繁榮時期從那裡帶到歐洲的。 然而,在墨西哥托盧卡谷洛克菲勒中心馬鈴薯站進行的研究迫使這一觀點被修改(Niederhauser 1993,XNUMX)。
1.在托盧卡河谷,當地塊莖馬鈴薯種(Solanum demissum,S。bulbocastanum等)具有不同的垂直抗性基因集和高水平的非特異性抗性基因,這表明與該寄生蟲長期共進化。 包括農作物馬鈴薯在內的南美物種缺乏抗性基因。
2.在托盧卡河谷中,發現了交配類型為A1和A2的分離株,結果致病疫霉的雜種很普遍。 而在南美栽培馬鈴薯的家鄉,寄生蟲呈克隆狀傳播。
3.在托盧卡河谷,每年都有晚疫病的嚴重流行。 因此,在北美研究人員(康奈爾大學)中,建立了關於中美洲(中美洲)作為馬鈴薯疫黴菌的發源地的觀點(Goodwin等,1994)。
南美研究人員不同意這一觀點。 他們認為,栽培馬鈴薯及其寄生的致病疫黴具有共同的家園-南美安第斯山脈。 他們通過分子研究來分析線粒體基因組(mtDNA)的DNA多態性以及核基因RAS和β-微管蛋白來支持他們的觀點(Gomez-Alpizar等,2007)。 他們表明,從世界各地收集的毒株來自三個不同的祖先系,這三個祖先系(全部三個)都在南美安第斯山脈中發現。 安第斯單體型是兩系的後代:在厄瓜多爾Anarrhicomenum部分的野生茄科中發現了最古老的mtDNA譜系分離株,而第二系的分離株常見於土豆,西紅柿和野生茄屬植物上。 在托盧卡(Toluca)中,即使罕見的單倍型也僅來自一個譜系,而托盧卡(Toluca)菌株的遺傳變異性(某些可變位點的等位基因頻率較低)表明由於最近的漂移而產生了強大的奠基者效應。
此外,在安第斯山脈發現了一個新的安第斯物種,在形態和遺傳上均與疫情對蝦相似,據作者稱,安第斯山脈是疫黴屬物種形成的熱點。 最後,在歐洲和美國,P。Infestans種群包括兩個安第斯血統,而在托盧卡只有一個。
該出版物引起了來自不同國家的一組研究人員的回應,他們做了很多實驗性工作以修改先前進行的研究(Goss等,2014)。 在這項工作中,首先,更多信息性的微衛星DNA序列被用於研究DNA多態性。 其次,用於分析聚類,遷移路徑,人口的時間差異等。 使用了更高級的模型(F統計量,貝葉斯近似等),第三,不僅與安第斯物種安第斯樹種進行了比較,在安第斯樹種中,安第斯樹還具有雜種性(致病疫黴x疫黴屬)。而且還有墨西哥特有種P. mirabilis,P。Ipomoeae和Phytophthora phaseoli,它們在同一進化枝中包括遺傳上接近的P. infestans(Kroon等人,2012)。 這些分析的結果明確表明,除雜種P. andina外,本研究中所有疫黴屬種的系統發育樹的根部均屬於墨西哥菌株,其遷移方向為墨西哥-安第斯山脈,反之亦然,其始端與歐洲一致。新世界的殖民化(300-600年前)。 因此,專攻馬鈴薯的致病疫黴物種的出現發生在結節性茄科植物(即馬鈴薯)形成的次生遺傳中心。 在中美洲。
P. INFESTANS的基因組
2009年,一個國際科學家團隊對完整的P infestans基因組進行了測序(Haas等,2009),其大小為240 MB。 這是引起大豆根腐病的緊密相關的大豆疫黴(95 Mb)和拉莫魯姆黴(65 Mb)的數倍,影響了橡樹,山毛櫸等珍貴樹種。 獲得的數據表明,基因組包含大量重複序列的副本-74%。 基因組包含17797個蛋白質編碼基因,其中大部分是涉及細胞過程的基因,包括DNA複製,蛋白質的轉錄和翻譯。
疫黴屬(Phytophthora)屬的基因組比較顯示,一個不尋常的基因組組織由保守基因序列塊組成,其中基因密度相對較高,重複序列的含量相對較低,單個區域具有非保守基因序列,基因密度較低且重複區域含量較高。 保守區佔所有疫黴菌蛋白編碼基因的70%(12440)。 在保守區中,基因通常緊密間隔,平均基因間距離為604 bp。 在保守區之間的區域,由於重複元件密度的增加,基因間距離更大(3700 bp)。 快速發展的效應子分泌基因位於基因貧乏地區。
致病疫黴基因組的序列分析表明,基因組的大約三分之一屬於轉座因子。 致病疫霉的基因組比其他已知基因組包含更多不同的轉座子家族。 P. infestans轉座子大多數都屬於吉普賽家族。
在致病疫霉的基因組中已經鑑定出許多與發病有關的特定基因家族。 它們的很大一部分編碼效應蛋白,該蛋白改變宿主植物的生理並促進其感染。 它們分為兩大類:在細胞間空間(質外體)中起作用的質外體效應子,以及通過haustoria進入細胞的胞質效應子。 質外體效應子包括破壞植物細胞的分泌的水解酶,例如蛋白酶,脂肪酶和糖基化酶。 宿主植物防禦酶的抑製劑;壞死性毒素,如Nep1樣蛋白(NPLs)和Pcf樣小的富含半胱氨酸的小蛋白(SCRs)。
致病疫霉的效應子基因很多,通常比非致病性基因大。 最著名的是胞質效應器RXLR和Crinkler(CNR)。 卵菌的典型胞質效應子是RXLR蛋白。 迄今為止發現的所有RXLR效應子基因均包含氨基末端基團Arg-XLeu-Arg,其中X是氨基酸。 研究結果表明,在致病疫霉的基因組中有563個RXLR基因,比大豆疫黴和ramorum的多60%。 致病疫黴基因組中的RXLR基因中大約有一半是物種特異性的。 RXLR效應器具有多種序列。 其中,確定了一個大家庭和150個小家庭。 與主要蛋白質組不同,RXLR效應子基因通常位於基因組的基因貧乏和重複富集區域。 確定這些區域活力的可移動元件促進了這些基因的重組。
細胞質CRN效應物最初在編碼植物組織壞死肽的致病疫黴轉錄物中鑑定。 自發現以來,對這些效應子的家族知之甚少。 對P. Infestans基因組的分析顯示,有一個龐大的196個CRN基因家族,比大豆假單胞菌(100 CRN)和拉美假單胞菌(19 CRN)大得多。 像RXLRs一樣,CRNs是模塊蛋白,由高度保守的N端LFLAK結構域(50個氨基酸)和包含不同基因的相鄰DWL結構域組成。 大多數CRN(60%)具有信號肽。
已經研究了各種CRN破壞宿主植物細胞過程的可能性。 在分析植物壞死時,去除CRN2蛋白可以鑑定由234個氨基酸組成的C端區域(位置173-407,DXG域)並引起細胞死亡。 對致病疫黴CRN基因的分析揭示了四個不同的C末端區域,它們也導致植物內的細胞死亡。 這些包括新鑑定的DC域(P. Infestans具有18個基因和49個假基因),以及與蛋白激酶相似的D2(14和43)和DBF(2和1)域。 植物中表達的CRN結構域蛋白在植物細胞中是保守的(在沒有信號肽的情況下),並通過細胞內機制刺激細胞死亡。 包含CRN域的另外255個序列很可能不充當基因。
RXLR和CRN效應基因家族的數量和大小的增加大概是由於非等位基因同源重組和基因重複。 儘管基因組包含大量的活性移動元件,但仍然沒有直接證據證明效應基因的轉移。
人口結構研究中使用的方法
群體遺傳結構的研究目前基於對組成菌株的純培養物的分析。 還針對特定目的進行了不分離純培養物的種群分析,例如,研究種群的攻擊性或其中存在對殺菌劑有抗性的菌株(Filippov等人,2004; Derevyagina等人,1999)。 這種類型的研究涉及使用特殊方法,其描述超出了本文的範圍。 對於菌株的比較分析,基於對DNA結構的分析和對錶型表現的研究,使用了許多方法。 群體的比較分析必須處理大量的分離株,這對所用方法提出了某些要求。 理想情況下,它們應滿足以下要求(Cooke,Lees,2004; Mueller,Wolfenbarger,1999):
-價格便宜,易於實施,不需要大量的時間花費,基於普遍可用的技術(例如PCR);
-必須生成足夠數量的獨立共性標記特徵;
-具有高再現性;
-使用最少量的組織進行檢查;
-特定於底物(培養物中存在的污染不應影響結果);
-不需要使用危險的程序和劇毒化學品。
不幸的是,沒有與上述所有參數相對應的方法。 為了比較研究當前的菌株,基於表型特徵的分析方法:對馬鈴薯和番茄品種(馬鈴薯和番茄小種)的毒力,交配類型,肽酶同工酶和葡萄糖-6-磷酸異構酶的光譜以及對DNA結構的分析:長度多態性限制性片段(RFLP),通常補充有雜交探針RG 57,微衛星重複序列分析(SSR和InterSSR),隨機引物(RAPD)擴增,限制性片段(AFLP)擴增,與移動元件序列同源的引物擴增(例如Inter SINE PCR),測定線粒體DNA單倍型。
對與致病疫黴一起使用的菌株進行比較研究的方法的簡要說明
表型標記性狀
“馬鈴薯”比賽
“馬鈴薯”種族是一種普遍研究和使用的標記。 “簡單馬鈴薯”種族具有一種馬鈴薯毒力基因,“複雜”基因至少有兩個。 Black等人(1953)總結了他們可獲得的所有數據後發現,疫黴菌種能夠用與致病疫黴毒力基因相對應的抗性基因感染該植物,並發現了感染該植物的1、2、3和4種。分別具有基因R1,R2,R3和R4,即寄生蟲與宿主之間的相互作用是根據基因原理進行的。 此外,布萊克(Black)在Gallegly和Malcolmson的參與下發現了抗性基因R5,R6,R7,R8,R9,R10和R11以及相應的種族(Black,1954; Black&Gallegly,1957; Malcolmson&Black,1966; Malcolmson,1970)。
關於來自不同地區的病原體的種族組成,有大量數據。 在不詳細分析這些數據的情況下,我們將僅顯示一個總體趨勢:使用具有新抗性基因或其組合的品種時,起初晚疫病有所減弱,但隨後出現並選擇了具有相應毒力基因的種族並恢復了晚疫病暴發。 在引入具有這些基因的品種的栽培之前,在收集的收集物中很少觀察到針對前四個抗性基因(R4-R1)的特異毒力,但是當病原體被攜帶這些基因的品種寄生時,有毒菌株的數量急劇增加。 另一方面,基因4-5在收藏中很常見(Shaw,11)。
在1980年代後期對生長季節中不同種族的比率進行的研究表明,在疾病發展的開始,具有低攻擊性和1-2個毒力基因的克隆在種群中占主導地位。
此外,隨著晚疫病的發展,原始克隆的濃度降低,具有高侵略性的“複雜”族的數目增加。 到本季末,後者的發生率達到100%。 當儲存塊莖時,侵略性降低並且單個毒力基因喪失。 克隆替換的動力學可以以不同的方式發生在不同的品種中(Rybakova&Dyakov,1990)。 但是,我們在2000年至2010年的研究表明,從附生植物的最開始就發現了從馬鈴薯和西紅柿分離出的菌株中的複雜種族。 這可能是由於俄羅斯疫黴菌種群的變化所致。
到1988-1995年,在不同區域中具有全部或幾乎所有毒力基因的“超級種族”的發生率達到70-100%。 例如,白俄羅斯,列寧格勒和莫斯科地區,北奧塞梯和德國都注意到了這種情況(Ivanyuk等,2002a,2002b; Polityko,1994; Schober-Butin等,1995)。
“番茄”競賽
在番茄品種中,僅發現了2種抗晚疫病基因-Ph1(Gallegly&Marvell,1955)和Ph2(Al-Kherb,1988)。 與馬鈴薯小種的情況一樣,番茄和致病疫黴之間的相互作用是逐基因進行的。 T0種族感染沒有抗性基因的品種(大多數工業用品種),T1種族感染帶有Ph1基因(渥太華)的品種,T2種族感染帶有Ph2基因的品種。
在俄羅斯,幾乎只在土豆上發現了T0。 T0在本賽季開始時盛行於番茄,但後來被T1比賽取代(Dyakov等,1975,1994)。 2000年之後,許多植物的馬鈴薯中的T1在附生開始時就開始出現。 在美國,馬鈴薯菌株對番茄以及T0,T1和T2小種均無致病性,而T1和T2對番茄則無害(Vartanian&Endo,1985; Goodwin等,1995)。
配合類型
為了進行研究,需要使用已知交配類型-A1和A2的測試(參考)菌株。 在燕麥瓊脂培養基的陪替氏培養皿中成對接種測試分離株。 溫育10天后,檢查平板在菌株接觸區的培養基中是否存在卵孢子。 有4個選項:菌株屬於A1交配類型(如果它與A2測試儀形成卵形,則屬於A2,如果它與A1測試儀形成卵形,如果與兩個測試儀均形成卵形,則屬於A1A2,或者如果不形成卵形孢子,則屬於無菌(00)沒有測試者(後兩組很少)。
為了更快速地確定交配類型,嘗試鑑定與交配類型相關的基因組區域,目的是進一步使用它們來通過PCR確定交配類型。 美國研究人員進行了第一個成功的鑑定該位點的實驗(Judelson等,1995)。 使用RAPD方法,他們能夠鑑定兩個交叉分離株的後代中與交配類型相關的W16區域,並設計了一對24 bp引物進行擴增(W16-1(5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3')和W16-2(5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3')在用限制酶HaeIII限制PCR產物後,可以分離出具有配對類型A1和A2的分離株。
韓國研究人員進行了另一項獲得PCR標記以確定交配類型的嘗試(Kim,Lee,2002)。 他們使用AFLP方法識別了特定產品。 結果,開發了一對引物PHYB-1(正向)(5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3')和PHYB-2(5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'),從而允許選擇性擴增與A2交配類型相關的基因組區域。 隨後,他們繼續這項工作並設計了引物5'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3'(INF-1,正向)和5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3'(INF-2),從而可以選擇性擴增Mat-A1區,這是具有交配型菌株的特徵A1。 當研究捷克共和國(Mazakova等人,2006),突尼斯(Jmour,Hamada,2006)和其他地區的疫黴菌種群時,使用交配類型的PCR診斷方法顯示了良好的結果。 在我們的實驗室(Mytsa,Elansky,未出版)中,分析了從俄羅斯不同地區(Kostroma,梁贊,阿斯特拉罕和莫斯科地區)的患病馬鈴薯和番茄器官中分離出的34種疫黴菌。 使用超過90%的特異性引物進行PCR分析的結果與通過傳統方法在營養培養基上進行交配類型的分析結果相吻合。
表1. Sib 1克隆內的抗性變異性(Elansky等,2001)
樣品收集地點 | 分析的分離物數量 | 敏感(S),弱抗性(SR)和抗性(R)菌株的數量,pcs(%) | ||
S | SR | R | ||
符拉迪沃斯托克(G. Vladivostok) | 10 | 1(10) | 4(40) | 5(50) |
赤塔 | 5 | 0 | 0 | 5(100) |
伊爾庫茨克 | 9 | 9(100) | 0 | 0 |
G.克拉斯諾亞爾斯克 | 13 | 12(92) | 1(8) | 0 |
葉卡捷琳堡市 | 15 | 8(53) | 1(7) | 6(40) |
薩哈林 | 66 | 0 | 0 | 66(100) |
鄂木斯克州 | 18 | 0 | 0 | 18(100) |
甲霜靈抗性作為種群標記
在1980年代初,在各個地區都發現了由抗甲霜靈的致病疫黴引起的晚疫病暴發。 許多國家的馬鈴薯農場遭受了重大損失(Dowley&O'Sullivan,1981; Davidse等,1983; Derevyagina,1991)。 從那以後,在世界上許多國家,已經持續監測了感染致病疫黴菌種群中對苯甲酰胺耐藥菌株的發生情況。 除了實際評估使用含苯酰胺的藥物的前景,建立保護措施體系和預測附生植物外,對這些藥物的耐藥性已成為廣泛用於對該病原體種群進行比較分析的標誌性特徵之一。 但是,在比較人群研究中使用甲霜靈抗藥性時應考慮到以下事實:1-尚未準確確定抗藥性的遺傳基礎,2-甲霜靈抗藥性是選擇性依賴的性狀,可隨苯酰胺的使用而變化,3-不同在一個克隆系中對甲霜靈菌株的敏感性程度(表1)。
同工酶譜
同工酶標記通常獨立於外部條件,表現出孟德爾遺傳並具有共性,從而可以區分純合子和雜合子。 蛋白質作為基因標誌物的使用使得既可以鑑定遺傳物質的大重組,包括染色體和基因組突變,也可以鑑定單個氨基酸替代。
蛋白質的電泳研究表明,大多數酶以幾種電泳遷移率不同的形式存在於生物體中。 這些部分是通過不同的基因座(同工酶或同工酶)或同一基因座的不同等位基因(同工酶或同工酶)編碼多種形式的酶的結果。 即,同工酶是一種酶的不同形式。 不同的形式具有相同的催化活性,但肽和電荷中的單個氨基酸取代略有不同。 在電泳過程中會發現這種差異。
在感染致病疫黴菌株的研究中,使用了兩種蛋白質的肽酶和6磷酸葡萄糖異構酶的同工酶譜(該酶在俄羅斯人群中是單態的,因此,本研究未介紹其研究方法)。 為了在電場中將它們分離為同功酶,將從研究的生物體中分離出的蛋白質製劑應用於放置在電場中的凝膠板上。 單個蛋白質在凝膠中的擴散速率取決於電荷和分子量;因此,在電場中,蛋白質混合物被分離成獨立的部分,可以使用特殊的染料將其可視化。
肽酶同工酶的研究是在醋酸纖維素,澱粉或聚丙烯酰胺凝膠上進行的。 最方便的方法是使用Helena Laboratories Inc.製造的醋酸纖維素凝膠的方法。 它不需要大量的測試材料,它允許人們在電泳後為兩個酶基因座在凝膠上獲得對比帶,其實施不需要大量的時間和材料成本(圖2)。
將一小塊菌絲體轉移到1,5 ml微管中,向其中加入1-2滴蒸餾水。 之後,將樣品均質化(例如,使用帶有適用於微管的塑料附件的電鑽),並在25 rpm的離心機上沉澱13000秒。 每個微管8μl。 將上清液轉移至塗藥板。
從緩衝容器中取出醋酸纖維素凝膠,將其吸乾在兩張濾紙之間,並將工作層向上放置在塗抹器的塑料底座上。 來自板的溶液通過施加器轉移2-4次到凝膠上。 凝膠轉移到電泳室,
表2.用於在肽酶同工酶分析中對醋酸纖維素凝膠染色的溶液組成,將一滴油漆(溴酚藍)放在凝膠的邊緣。
TRIS HCl,0,05M,pH 8,0 2毫升
過氧化物酶1000 U / ml 5滴
鄰二苯胺啶,4毫克/毫升8滴
氯化鎂,2毫克/毫升20滴
Gly-Leu,15毫克/毫升10滴
L-氨基酸氧化酶,20 u / ml 2滴
電泳進行20分鐘。 在200 V下進行電泳。將凝膠轉移到噴漆台上,並用特殊的噴漆溶液染色(表2)。 將10 ml 1,6%DIFCO瓊脂在微波爐中初步融化,冷卻至60°C,然後將2 ml瓊脂與塗料混合物混合併倒入凝膠中。 條紋會在15-20分鐘內出現。 在將溶液與熔融瓊脂混合之前,立即添加L-氨基酸氧化酶試劑。
在俄羅斯人群中,Pep 1位點由100/100和92/100基因型表示。 純合子92/92極為罕見(約0,1%)。 Rehr 2基因座由三種基因型100 / 100、100 / 112和112/112代表,並且所有3個變體都很常見(Elanky和Smirnov,2003,圖2)。
基因組研究
限制性片段長度多態性及隨後的雜交(RFLP-RG 57)
用Eco R1限制酶處理總DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段。 核DNA非常大並且具有許多重複序列,這使得直接分析通過限制性酶作用獲得的眾多片段變得困難。 因此,在凝膠中分離的DNA片段被轉移到特殊的膜上,並用於與RG 57探針雜交,該探針包括用放射性或熒光標記物標記的核苷酸。 該探針與重複的基因組序列雜交(Goodwin等,1992,Forbes等,1998)。 可視化在光或放射性物質上雜交的結果後,獲得了多位點雜交圖譜(指紋圖譜),由25-29個片段表示(Forbes等,1998)。 無性(無性)後代將具有相同的特徵。 通過電泳條帶的排列,可以判斷所比較生物體的異同。
線粒體DNA單倍型
在大多數真核細胞中,mtDNA以雙鏈環狀DNA分子的形式存在,與真核細胞的核染色體不同,它是半保守複製的,並且與蛋白質分子無關。
對致病疫霉的線粒體基因組進行了測序,並且許多工作致力於限制性片段長度的分析(Carter等,1990; Goodwin,1991; Gavino,Fry,2002)。 在Griffith和Shaw(1998)開發出一種簡單,快速的mtDNA單倍型測定方法後,該標記成為P.Infestans研究中最受歡迎的標記之一,該方法的實質是用引物F2-R2和F4-R4順序擴增兩個線粒體DNA片段(來自共同基因組)。 F3-R1(表1)及其隨後的限制酶MspI(第一個片段)和EcoR2(第二個片段)的限制。 該方法允許您識別4個單倍型:Ia,IIa,Ib,IIb。 II型與I型的不同之處在於1881 bp插入片段的存在以及P2和P4區域中限制性酶切位點的不同位置(圖3)。
自1996年以來,在俄羅斯境內收集的毒株中,僅注意到單倍型Ia和IIa(Elansky等人,2001,2015)。 可以在電場中用引物F2-R2分離限制性酶切產物後對其進行鑑定(圖4、5)。 mtDNA類型用於菌株和種群的比較分析。 在許多工作中,線粒體DNA的類型被用於分離克隆系,並通入致病疫黴菌分離株(Botez等,2007; Shein等,2009)。 使用PCR-RFLP方法,得出的結論是,在相同的致病疫黴中,mtDNA是異質的(Elansky和Milyutina,2007)。 放大條件:1x(500秒94°C),40x(30秒90°C,30秒52°C,90秒72°C); 1x(5分鐘。72°C)。 反應混合物:(20μl):0,2 U Taq DNA聚合酶,1x 2,5 mM MgCl2-Taq緩衝液,每個0,2 mM dNTP,30 pM引物和5 ng分析的DNA,去離子水-最多20μl。
PCR產物的限制在4℃的溫度下進行6-37小時。 限制性混合物(20μl):10x MspI(2μl),10x限制性緩衝液(2μl),去離子水(6μl),PCR產物(10μl)。
表3.用於擴增mtDNA多態性區域的引物
軌跡 | 底漆 | 引物長度和位置 | PCR產物長度 | 限制酶 |
---|---|---|---|---|
P2 | F2:5'-TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2:5'-TTACGGCGGTTTTCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4:5'-TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | 生態研究所 |
R4:5-CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
隨機引物擴增(RAPD)
進行RAPD時,使用具有任意核苷酸序列的引物(有時同時使用多個引物),通常具有10個核苷酸的長度,且GC核苷酸的含量高(佔50%),退火溫度低(約35°C)。 這樣的引物“落在”基因組的許多互補位點上。 擴增後,獲得大量擴增子。 它們的數量取決於所使用的引物和反應條件(MgCl2濃度和退火溫度)。
通過在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠中蒸餾進行擴增子的可視化。 在進行RAPD分析時,有必要仔細監測被分析物質的純度,因為其他生物物體的污染會導致工件數量的顯著增加,在分析純淨材料時,數量非常多(Perez等,1998)。 該方法在研究致病疫霉的基因組中的應用反映在許多著作中(Judelson,Roberts,1999; Ghimire等,2002; Carlisle等,2001)。 反應條件和引物的選擇(研究了51個10個核苷酸的引物)在Abu-El Samen等人,(2003)的文章中給出。
微衛星重複分析(SSR)
微衛星重複序列(簡單序列重複序列,SSR)是串聯重複存在於所有真核生物核基因組中的1-3個(有時多達6個)核苷酸的短序列。 連續重複的數量可以在10到100之間變化。微衛星基因座以相當高的頻率出現,或多或少均勻地分佈在整個基因組中(Lagercrantz等,1993)。 微衛星序列的多態性與基本基序重複次數的差異有關。 微衛星標記具有共性,因此可以將其用於分析種群結構,確定親屬關係,基因型遷移途徑等。 這些標記的其他優點中,應注意其高多態性,良好的可重複性,中性以及執行自動分析和評估的能力。微衛星重複序列的多態性分析是通過PCR擴增進行的,該引物使用了與微衛星基因座側翼獨特序列互補的引物。 最初,在聚丙烯酰胺凝膠上分離反應產物進行分析。 後來,Applied Biosystems公司的員工提議使用熒光標記的引物,先使用自動激光檢測器(Diehl等,1990),然後使用標準的自動DNA測序儀(Ziegle等,1992)來檢測反應產物。 用各種熒光染料標記引物可讓您一次在一個泳道上分析多個標記,從而顯著提高了方法的生產率並提高了分析的準確性。
第一批致力於利用SSR分析研究疫黴菌的出版物出現在2000年代初。 (Knapova,Gisi,2002年)。 並非所有作者提出的標記都顯示出足夠的多態性,但是,Lees等人(4年)提出的11個SSR標記中包括了其中的兩個(12B和G2006),隨後被Eucablight研究網絡採用(www.eucablight (.org)作為P. infestans的標準。 幾年後,發表了關於創建基於八種SSR標記的疫病菌DNA多重分析系統的研究(Li等,2010)。 最後,在評估了所有先前提出的標記並選擇了最有信息的標記,並優化了引物,熒光標記和擴增條件後,同一組作者提出了一個包含12個標記的一步式多重分析系統(表4; Li等。 ,2013a)。 選擇該系統中使用的引物,並用四個熒光標記(FAM,VIC,NED,PET)之一進行標記,以使具有相同標記的引物的等位基因大小範圍不重疊。
作者使用QIAGEN多重PCR試劑盒或QIAGEN Typeit微衛星PCR試劑盒在PTC200放大器(美國MJ Research)上進行了分析。 反應混合物的體積為12.5μL。 擴增條件如下:對於QIAGEN多重PCR:95°C(15分鐘),30x(95°C(20秒),58°C(90秒),72°C(60秒),72°C(20分鐘);對於QIAGEN Type-it微衛星PCR: 95°C(5分鐘),28x(95°C(30秒),58°C(90秒),72°C(20秒),60°C(30分鐘)。
使用ABI3730自動毛細管DNA分析儀(Applied Biosystems)進行PCR產物的分離和可視化。
表4.用於致病疫霉的基因分型的12種標準SSR標記的特徵(Li等,2013a)
名稱 | 等位基因數 | 尺寸範圍 等位基因(bp) | 底漆 |
豬11 | 13 | 130-180 | F:NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R:GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F:NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R:GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F:NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R:GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F:FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R:GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F:FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R:GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F:FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R:GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F:VIC-AGCGGCTTACCGATGG R:GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F:VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R:CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F:GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R:VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F:VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R:CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F:PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R:GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F:PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R:GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
可視化分析結果的示例如圖6所示。 3.7.使用GeneMapper 1軟件,通過將獲得的數據與已知分離株的數據進行比較,對結果進行了分析。 為了便於分析結果的解釋,有必要在每個研究中包括2-XNUMX個具有已知基因型的參考分離株。
在大量現場樣本上測試了提出的研究方法,之後作者對兩個組織的實驗室-英國詹姆斯·赫頓研究所(英國)和瓦赫寧根大學與研究機構(荷蘭)之間的協議進行了標準化,並簡化了使用標準FTA卡的可能性。感染致病疫黴DNA樣品的收集和運輸使人們有可能談論這種開發的商業用途。 此外,使用多重SSR分析的快速準確的分型疫黴菌基因分型方法,使得有可能在全球範圍內對該病原體種群進行標準化研究,並在Eucablight項目(www.eucablight.org)的框架內建立了晚疫病世界數據庫,包括包括微衛星分析的結果,使得追踪全球新基因型的出現和傳播成為可能。
擴增的限制性片段長度多態性(AFLP)。 AFLP(擴增的片段長度多態性)是一種使用特定引物生成隨機分子標記的技術。 在AFLP中,DNA用兩種限制酶結合處理。 將特定的銜接子連接至限製片段的粘性末端。
然後使用與銜接子序列和限制性位點互補的引物擴增這些片段,並在其3'末端另外帶有一個或多個隨機鹼基。 所獲得的片段集取決於限制性內切酶和在引物的3'端隨機選擇的核苷酸(Vos等,1995)。 AFLP-基因分型用於快速研究各種生物的遺傳變異。
Mueller,Wolfenbarger,1999,Savelkoul et al。,1999的工作中對該方法進行了詳細說明。中國研究人員已經完成了許多比較AFLP和SSR方法分辨率的工作。 研究了從華北五個地區收集到的48個P. infestans分離株的表型和基因型特徵。 與未發現多樣性的SSR基因型相比,AFLP譜揭示了八種不同的DNA基因型(Guo等,2008)。
用與活動元件序列同源的引物進行擴增
從反轉錄轉座子序列衍生的標記對於遺傳作圖,遺傳多樣性和進化過程的研究非常方便(Schulman,2006)。 如果製備引物以補充某些可移動元件的穩定序列,則可以擴增位於它們之間的基因組區域。 在晚疫病的致病因素研究中,成功地使用了一種與SINE(短穿插式核元件)Retropazone核心序列互補的引物來擴增基因組部分的方法(Lavrova和Elansky,2003)。 使用這種方法,即使在一個分離株的無性後代中也發現了差異。 就這一點而言,可以得出結論:SINE間PCR方法具有高度特異性,而疫黴菌基因組中SINE元素的移動速率也很高。
在致病疫霉的基因組中,已鑑定出12個短逆轉錄轉座子(SINE)家族。 研究了短逆轉錄轉座子的物種分佈,鑑定了僅在致病疫黴中發現的元素(SINE)(Lavrova,2004)。
菌株比較研究方法在人群研究中的應用特點
計劃研究時,有必要清楚地了解其追求的目標並使用適當的方法。 因此,某些方法可以生成大量獨立的標記特徵,但同時具有較低的重現性,並且在很大程度上取決於所用試劑,反應條件和所研究材料的污染。 因此,在一組菌株的每次研究中,有必要使用幾種標準(參考)菌株,但即使在這種情況下,也很難將幾種實驗的結果結合起來。
這組方法包括RAPD,AFLP,InterSSR,InterSINE PCR。 擴增後,獲得了大量不同大小的DNA片段。 如果有必要在密切相關的菌株(親本,後代,野生型突變體等)之間建立差異,或者在需要對小樣本進行詳細分析的情況下,建議使用此類技術。 因此,AFLP方法被廣泛用於致病疫霉的遺傳作圖(van der Lee等,1997)和種群內研究(Knapova,Gisi,2002; Cooke等,2003; Flier等,2003)。 在創建菌株數據庫時,此類方法不適合使用,因為在不同的實驗室進行分析時,實際上不可能統一結果的核算。
儘管看似簡單且執行速度快(DNA分離而沒有良好的純化,擴增,結果可視化),這組方法仍需要使用一種特殊的方法來記錄結果:在帶有標記的(放射性或發光)引物的聚丙烯酰胺凝膠中蒸餾,然後暴露於光或放射性物質中。 傳統的溴化乙錠瓊脂糖凝膠成像通常不適用於這些方法,因為大量不同大小的DNA片段可以融合。
相反,其他方法允許以極高的可重複性生成少量特徵。 該小組包括研究線粒體DNA單倍型(在俄羅斯僅注意到兩個單倍型Ia和IIa),交配型(大多數分離株分為2種類型:A1和A2,很少發現自育性SF)和肽酶同工酶譜(兩個基因座Pep1和Pep2 ,每個由兩個同工酶組成)和6-磷酸葡萄糖異構酶(在俄羅斯,該特性沒有變異,儘管在世界其他國家/地區也發現了明顯的多態性)。 建議在分析館藏,編譯區域和全球數據庫時使用這些功能。 在分析線粒體DNA的同工酶和單倍型的情況下,可能完全不需要標準菌株,而在交配類型分析中,需要兩個已知交配類型的測試分離株。
反應條件和試劑只能影響電泳圖中產物的對比度;在這些類型的研究中不太可能出現偽影。
目前,俄羅斯歐洲部分的大多數人口都以兩種交配菌株為代表(表6),其中有線粒體DNA Ia和IIa類型的分離株(1993年後在俄羅斯尚未發現世界上其他類型的mtDNA)。 肽酶同工酶譜由Pep1位點的兩個基因型(100 / 100、92 / 92和雜合子92/100,而92/92基因型非常罕見(<0,3%))和Pep 2位點的兩個基因型(100/100)表示,112/112和雜合子100/112,其中基因型112/112的發生頻率低於100/100,但也很常見。
6年以後(1993-US克隆的消失),葡萄糖-1-磷酸異構酶的同工酶譜沒有變化;所有研究菌株均具有100/100基因型(Elansky和Smirnov,2002)。
第三組方法使得有可能獲得足夠一組具有高再現性的獨立標記物字符。 今天,該組包括RFLP-RG57探針,該探針可產生25-29個不同大小的DNA片段。 在分析樣本和編譯數據庫時,都可以使用RFLP-RG57。 但是,這種方法比以前的方法昂貴得多,費時,並且需要足夠數量的高度純化的DNA。 因此,研究人員被迫限制被測材料的體積。
RFLP-RG57在上世紀90年代初期的發展極大地加強了對晚疫病致病菌的研究。 它成為基於“克隆線”的選擇和分析的方法的基礎(請參見下文)。 與RFLP-RG57一起使用的是交配類型,DNA指紋圖譜(RFLP-RG57方法),肽酶和6磷酸葡萄糖異構酶同工酶譜以及線粒體DNA類型,以鑑定克隆系。 多虧了他,他等人在1994年證明了這一點,用新人替代了舊人的種群(Drenth等人,1993; Sujkowski等人,1994; Goodwin等人,1995a),並且確定了在世界許多國家盛行的克隆世系。 使用這種方法對俄羅斯菌株進行的研究表明,歐洲部分菌株具有很高的基因型多態性,俄羅斯亞洲和遠東地區的種群具有單態性(Elansky等,2001)。 現在,這種方法仍然是感染晚疫病菌的主要研究方法。 但是,由於其較高的成本和執行過程中的勞動強度,阻礙了它的廣泛分佈。
在感染晚疫病研究中很少使用的另一種有前途的技術是微衛星重複(SSR)分析。 目前,該方法被廣泛用於分離克隆系。 對於菌株的分析,表型標記性狀如馬鈴薯品種的毒力基因的存在(Avdey,1995; Ivanyuk等,2002; Ulanova等,2003)和番茄被廣泛使用(並繼續使用)。 到目前為止,由於絕大多數分離物中出現了最大數量(或接近數量)的毒力基因,對馬鈴薯變種的毒力基因已失去其作為種群研究的標記性狀的價值。 同時,攜帶相應Ph1基因的番茄品種的T1毒力基因仍被成功用作標記性狀(Lavrova等,2003; Ulanova等,2003)。
在許多作品中,對殺菌劑的抗性被用作標誌性狀。 由於在田間施用含甲霜靈(或甲霜靈)的殺真菌劑後,克隆系中很容易出現抗藥性突變,因此該特性在種群研究中不受歡迎。 例如,在Sib1克隆系中顯示出抗性水平的顯著差異(Elansky等,2001)。
因此,交配型,肽酶同工酶譜,線粒體DNA型,RFLP-RG57,SSR是用於在數據庫中創建數據庫和標記菌株的首選標記特徵。 為了比較有限的樣本,如果有必要使用最大數量的標記功能,則可以使用AFLP,RAPD,InterSSR,SINE間PCR(表5)。 但是,應記住,這些方法的重現性很差,在每個單獨的實驗(擴增電泳循環)中,有必要使用幾種參考分離物。
表5.不同菌株研究方法的比較 P.Infestans
標準 | TS | Isofer警察 | 脫氧核糖核酸 | RFLP-RG57 | RAPD | 固態繼電器 | SSR | 空軍基地 | 啟 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
信息量 | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
重現性 | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
文物的可能性 | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
成本 | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
勞動強度 | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
分析速度** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
注意:H-低,C-中,B-高; НС*-使用瓊脂糖凝膠或自動時勞動強度低
基因型鑑定儀,中等-通過在聚丙烯酰胺凝膠中用標記的引物蒸餾,
**-不計算用於分離DNA的菌絲體生長所花費的時間。
人口結構
克隆系
在沒有重組或其對種群結構的微不足道的貢獻的情況下,種群由一定數量的克隆組成,它們之間的遺傳交換極為罕見。
在這類人群中,研究單個基因的頻率而不是研究具有共同起源(克隆系或克隆譜系)且僅在點突變上有所不同的基因型的頻率更有意義。 自上世紀57年代初RFLP-RG90方法問世以來,晚疫病病原體的種群研究和克隆系分析已大大加快。 與RFLP-RG57一起使用的是交配類型,肽酶和6-磷酸葡萄糖異構酶同工酶譜以及線粒體DNA類型,以鑑定克隆系。 表6顯示了最常見的克隆系的特徵。
克隆US-1一直統治著世界各地的人口,直到80年代末,此後它開始被其他克隆所取代,並從歐洲和北美消失了。 現在在非洲的遠東地區(菲律賓,台灣,中國,日本,韓國,Koh等人,1994,Mosa等人,1993),非洲(烏干達,肯尼亞,盧旺達,Goodwin等人,1994,Vega-Sanchez等人)發現了它。等人,2000; Ochwo等人,2002)和南美(厄瓜多爾,巴西,秘魯,福布斯等人,1997; Goodwin等人,1994)。 僅在澳大利亞沒有發現屬於US-1品系的菌株。 顯然,致病疫霉的分離株是另一波移民潮來到澳大利亞的(Goodwin,1997)。
克隆US-6在70年代末從墨西哥北部遷移到加利福尼亞,並在32年無病後在馬鈴薯和西紅柿中引起流行。 由於它的高侵略性,它取代了US-1克隆並開始在美國西海岸占主導地位(Goodwin等,1995a)。
基因型US-7和US-8於1992年在美國發現,1994年已經在美國和加拿大廣泛分佈。 在一個田間季節中,克隆US-8幾乎能夠完全取代克隆US-1在最初以相同濃度感染兩個克隆的馬鈴薯田中(Miller and Johnson,2000)。
BC-1至BC-4克隆已在不列顛哥倫比亞省的Goodwin等人,1995b)的少量分離物中鑑定出來。 克隆US-11在美國廣泛傳播,並在台灣取代US-1。 JP-1和EC-1克隆以及US-1克隆分別在日本和厄瓜多爾很常見(Koh等,1994; Forbes等,1997)。
SIB-1是在俄羅斯從莫斯科地區到薩哈林島的廣闊領土上盛行的克隆。 在莫斯科地區,它於1993年被發現,一些田間種群主要由該克隆系的菌株組成,對甲霜靈具有高度抗性。 1993年之後,該克隆的患病率顯著下降。 在1997年至1998年的烏拉爾山脈以外,除哈巴羅夫斯克地區(在當地廣泛分佈有SIB-1克隆)外,隨處可見SIB-2。 不同交配類型的克隆在空間上的分離排除了西伯利亞和遠東地區的有性繁殖過程。 與西伯利亞相比,在莫斯科地區,人口眾多。 幾乎每個分離株都有獨特的多基因座基因型(Elansky等,2001,2015)。 這種多樣性不能僅僅通過從世界不同地區進口具有進口種子材料的真菌菌株來解釋。 由於兩種交配都在種群中發生,因此其多樣性也可能是由於重組造成的。 因此,在不列顛哥倫比亞省,由於克隆BC-2和US-3的雜交,推測基因型BC-4,BC-1和BC-6的出現(Goodwin等,1995b)。 在莫斯科人群中可能會發現雜種菌株。 例如,PEP基因座的雜合株MO-4,MO-8和MO-11可以是具有A12配對類型且PEP基因座的一個等位基因是純合的菌株MO-21,MO-22,MO-2之間的雜種。 MO-8,具有A1交配類型,並且對於該基因座的另一個等位基因是純合的。 而且如果是這種情況,並且在現代感染無疫桿菌中有增加性過程作用的趨勢,那麼多基因座克隆分析的信息價值將下降(Elansky et al。,2001,2015)。
克隆系的變異
直到90世紀20年代,無性系US-1才在世界範圍內普及。 大多數田間和地區人口僅由具有US-1基因型的菌株組成。 但是,還觀察到分離株之間的差異,很可能是由突變過程引起的。 核DNA和線粒體DNA均發生突變,並且除其他因素外,還影響了對苯酰胺藥物的抗藥性水平和毒力基因的數量。 原始基因型名稱後面的點後的其他數字表示在突變方面與原始基因型不同的譜系(例如,US-1.1克隆譜系的US-1突變體譜系)。 指紋圖譜US-1.5和US-1.6包含大小不同的輔助線(Goodwin等,1995a,1995b); 克隆系US-6.3與US-6的區別還在於一條附屬系(Goodwin,1997,表7)。
在研究線粒體DNA時,發現在克隆系US-1中僅發現1b型線粒體DNA(Carter等人,1990)。 但是,在秘魯和菲律賓的這種克隆譜系的菌株研究中,發現存在插入和缺失的情況下,線粒體DNA類型不同於1b的分離株(Goodwin,1991,Koh等,1994)。
表6.一些P. infestans克隆系的多基因座基因型
名稱 | 配合類型 | 同工酶 | DNA指紋 | MtDNA類型 | |
GPI | PEP | ||||
美1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
美2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
美3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
美4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
美5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
美6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | b |
美7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
美8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
美9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
美10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
美11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | b |
美12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
美14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
美15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
美16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
美17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
美18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
美19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | a |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | a |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | a |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | a |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | a |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | a |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | a |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | a |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | a |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | a |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | a |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | a |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | a |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | a |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | a |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | a |
注意:*-無數據。
表7.多基因座基因型及其突變株
名稱 | 配合類型 | | DNA指紋(RG57) | 筆記 | |
GPI | PEP-1 | ||||
美1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | 原始基因型1 |
美1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | PEP突變 |
美1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | RG57中的突變 |
美1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | RG57中的突變 |
美1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | RG57和PEP中的突變 |
美1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | RG57中的突變 |
美6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | 原始基因型2 |
美6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | PEP突變 |
美6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | RG57中的突變 |
美6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | RG57中的突變 |
美6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | RG57和PEP中的突變 |
美6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | RG57中的突變 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | 原始基因型3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | RG57中的突變 |
同工酶譜也有變化。 通常,它們是由最初對該酶雜合的生物體分解為純合的生物體引起的。 在1993年,我們在番茄果實上鑑定了具有US-1特徵的菌株:RG57指紋圖譜,線粒體DNA類型和葡萄糖-86-磷酸異構酶的100/6基因型,但第一個肽酶基因座是純合子(100/100),而不是該克隆系典型的92/100雜合子。 我們命名了該菌株MO-17的基因型(表6)。 突變株US-1.1和US-1.4與US-1的區別還在於第一肽酶基因座處的突變(表7)。
導致馬鈴薯和番茄品種毒力基因數量改變的突變是很普遍的。 在荷蘭(Drenth等,1),秘魯(Goodwin等,1994a),波蘭(Sujkowski等,1995),北美北部(Goodwin等,, 1991)的種群的克隆系US-1995中被發現。 (7年)。 在加拿大和美國的克隆品系US-8和US-1995中,馬鈴薯毒力基因的數量也有差異(Goodwin等,1a),在俄羅斯亞洲部分的SIB-2001品系中也有差異(Elansky等,XNUMX)。 )。
在單克隆田間種群中鑑定出對苯甲酰胺類藥物的耐藥性水平差異很大的分離株,所有這些菌株均屬於克隆系Sib-1(Elansky等,2001,表1)。 幾乎所有克隆品系US-1都對甲霜靈高度敏感;但是,在菲律賓(Koh等,1994)和愛爾蘭(Goodwin等,1996)分離出了該品系的高抗性分離株。
致病疫霉的現代種群
中美洲(墨西哥)
墨西哥的疫病菌種群與其他世界種群明顯不同,這主要是由於其歷史地位。 對該種群和疫黴屬(Phytophthora)進化枝相關致病菌物種以及茄屬(Solanum)屬的本地物種的大量研究得出的結論是,病原體在墨西哥中部的進化與宿主植物的進化同時發生,並且與有性重組有關(Grünwald,Flier ,2005)。 兩種交配都以相同的比例出現在種群中,在土壤中的卵孢子存在於馬鈴薯和與野生相關的茄科植物的塊莖和馬鈴薯上,這證實了種群中存在性過程(Fernández-Pavía等,2002)。 托盧卡河谷及其周圍環境(病原體的推測起源中心)的最新研究證實,致病疫霉的本地種群具有很高的遺傳多樣性(在134個樣本中有176個多基因座基因型),並且在該地區存在著幾個分化亞群(Wang等人,2017)。 造成這種分化的因素包括墨西哥中部高地亞種群的空間劃分,在山谷和山區使用的栽培條件和馬鈴薯品種的差異以及存在可以作為替代寄主的馬鈴薯塊莖(Fry et al。 (2009年)。
但是,應該指出的是,墨西哥北部的疫病菌種群在本質上更具有克隆性,與北美種群更相似,這可能表明這些是新的基因型(Fry等人,2009)。
北美
北美致病疫黴菌種群一直具有非常簡單的結構,其克隆特性在使用微衛星分析之前就已經確立。 直到1987年,US-1克隆系在美國和加拿大占主導地位(Goodwin等,1995)。 在70年代中期,當出現基於甲霜靈的殺真菌劑時,該克隆開始被從墨西哥遷移的其他更具抗性的基因型所取代(Goodwin等,1998)。 到90年代末。 US-8基因型在美國完全取代了US-1基因型,並成為馬鈴薯上的優勢克隆系(Fry等,2009; Fry等,2015)。 番茄的情況有所不同,番茄經常包含多個克隆系,其組成每年都在變化(Fry等,2009)。
2009年,美國爆發了一場晚疫病大規模流行,原因是西紅柿。 這種大流行的一個特徵是在美國東北部的許多地方幾乎同時發作,並且與大花園中心大量感染番茄幼苗的銷售有關(Fry等人,2013)。 莊稼損失巨大。 對受影響樣品的微衛星分析表明,該大流行菌株屬於克隆系US-22 A2型交配。 2009年,該基因型在美國感染不動桿菌中的比例達到80%(Fry等人,2013)。 在隨後的幾年中,侵略性基因型US-23(主要在番茄上)和US-24(在馬鈴薯上)的比例穩步增加,但是,在2011年之後,US-24的檢出率顯著下降,迄今為止,約佔病原體種群的90%美國以US-23基因型為代表(Fry等人,2015)。
在加拿大,就像在美國一樣,在90年代末。 顯性基因型US-1被US-8取代,其顯性位置一直保持到2008年。 在加拿大,有嚴重的晚疫病流行與出售受感染的番茄幼苗有關,但它們是由基因型US-2009和US-2010引起的(Kalischuk等人,23)。 這些基因型在地理上的明顯區別是顯著的:US-8主導了加拿大的西部省份(2012%),而US-23主導了東部省份(68%)。 在隨後的幾年中,US-8傳播到東部地區;但是,總體上,在該國出現US-83和US-23基因型的背景下,其在人口中的份額略有下降(Peters等,22)。 迄今為止,US-24在整個加拿大都保持著主導地位。 US-2014位於不列顛哥倫比亞省,而US-23和US-8位於安大略省(Peters,23)。
因此,北美疫霉的種群主要是克隆系。 在過去的40年中,檢測到的克隆基因型數量已達到24種。儘管人口中存在兩種交配菌株,但由於性重組而出現新基因型的可能性仍然很低。 然而,在過去的20年中,已經記錄了幾例短暫的重組群體出現的情況(Gavino等,2000; Danies等,2014; Peters等,2014),在一種情況下,雜交的結果是基因型US-11。 ,這在北美已經根深蒂固了很多年(Gavino等,2000)。 直到2009年,人口結構的變化與新的,更具侵略性的基因型的出現有關,這些基因型隨後又遷移了先前占主導地位的前任。 2009-2010年發生了什麼在美國和加拿大,附生植物首次表明,在全球化時代,該病的暴發與出售受感染的種植材料時新基因型的活躍傳播有關。
南美洲
直到最近,對南美感染疫病菌的研究還沒有進行常規或大規模的研究。 眾所周知,這些種群的結構非常簡單,每個國家包括1-5個克隆世系(Forbes等,1998)。 因此,到1998年,基因型US-1(巴西,智利)BR-1(巴西,玻利維亞,烏拉圭,巴拉圭),EC-1(厄瓜多爾,哥倫比亞,秘魯和委內瑞拉),AR-1,AR -2,AR-3,AR-4和AR-5(阿根廷),PE-3和PE-7(秘魯南部)。 A2型交配存在於巴西,玻利維亞和阿根廷,在喀喀湖地區的玻利維亞-秘魯邊界外未發現,其後EC-1 A1基因型在安第斯山脈占主導地位。 在西紅柿上,US-1仍然是整個南美地區的主要基因型。
這種情況在2000年代或多或少一直存在。 重要的一點是在安第斯山脈北部的馬鈴薯野生近緣親緣種(S. brevifolium和S.tetrapetalum)上發現了一種新的A2型EC-2克隆系(Oliva等,2010)。 系統發育研究表明,該品係與致病疫黴並不完全相同,儘管與之密切相關,因此,建議將其與從安第斯山脈生長的番茄S.ceceum分離得到的另一種品系EC-3一起考慮,一個新的物種叫做P. andina; 然而,該物種的狀態(一個獨立的物種或致病疫霉的雜種,還有一些尚不清楚的系)的狀態仍不清楚(Delgado等,2013)。
當前,南美感染疫黴菌的所有種群都是克隆的。 儘管存在兩種類型的交配,但尚未鑑定出重組種群。 在番茄上,US-1基因型無處不在,顯然是由本地菌株取代了馬鈴薯,確切的起源尚不清楚。 在巴西,玻利維亞和烏拉圭,存在BR-1基因型。 在秘魯,除了US-1和EC-1,還有其他幾種本地基因型。 在安第斯山脈中,優勢地位被克隆系EC-1保留,該克隆係與最近發現的P. andina的關係尚待探索。 2003-2013年期間唯一的“不穩定”地方。 人口發生了重大變化,成為了智利(Acuña等,2012),2004-2005年。 病原體種群以對甲霜靈的抗性和新的線粒體DNA單倍型(Ia代替以前的Ib)為特徵。 2006至2011 在人口中,基因型21(根據SSR)占主導地位,其份額達到90%,此後棕櫚變為基因型20,其在未來兩年內的發生頻率保持在約67%(Acuña,2015)。
歐洲
在歐洲的歷史上,至少有兩次波日疫病菌從北美遷徙的浪潮是在1世紀。 (HERB-1)和70世紀初(US-1)。 含甲霜靈的殺菌劑在XNUMX年代無處不在。 導致優勢基因型US-XNUMX的置換並被新的基因型替代。 結果,在西歐的大多數國家中,病原體的種群主要由幾種克隆系代表。
使用微衛星分析法對病原體種群進行分析可以揭示2005-2008年在西歐發生的嚴重變化,2005年在英國發現了一種新的克隆系,稱為13_A2(或“ Blue 13”),其特徵是A2交配類型,具有很高的侵略性和對苯甲酰胺的抗性(Shaw et al。,2007)。 2004年在荷蘭和法國北部收集的樣本中發現了相同的基因型,這表明它是從歐洲大陸遷移到英國的,可能是用種土豆遷移的(Cooke等,2007)。 對該克隆系代表基因組的研究表明其序列具有高度的多態性(到2016年,其亞克隆變異數達到340個),並且基因表達水平的顯著程度變異,包括植物感染期間的效應子基因(Cooke等人,2012; Cooke,2017)。 這些特徵以及生物營養期的持續時間增加,可能會導致13_A2的侵略性增強,甚至感染耐晚疫病的馬鈴薯品種。
在接下來的幾年中,該基因型在西北歐洲國家(英國,愛爾蘭,法國,比利時,荷蘭,德國)迅速傳播,同時取代了先前佔優勢的基因型1_A1、2_A1、8_A1(Montarry等,2010; Gisi等。 ,2011; Van den Bosch等人,2011;庫克,2015;庫克,2017)。 根據www.euroblight.net網站,在這些國家的人口中13_A2的比例達到60-80%甚至更高; 在東歐和南歐的一些國家也記錄了這種基因型的存在。 但是,在2009-2012年。 13_A2在大不列顛和法國失去了統治地位,屈服於6_A1品系(愛爾蘭為8_A1),在荷蘭和比利時則部分被基因型1_A1、6_A1和33_A2取代(Cooke等人,2012; Cooke,2017; Stellingwerf,2017)。
迄今為止,西歐感染致病菌的約70%是單克隆的。 根據網站www.euroblight.net的數據,西北歐洲國家(英國,法國,
荷蘭,比利時)的比例大致相同,分別為13_A2和6_A1,實際上在指定區域之外(愛爾蘭除外)找不到後者,但已經至少有58個亞克隆(Cooke,2017年)。 變化13_A2在德國以明顯的數量出現,在中歐和南歐國家也偶爾出現。 基因型1_A1佔比利時人口的很大一部分,部分是荷蘭和法國。 基因型8_A1在歐洲人口中穩定在3-6%的水平上,愛爾蘭除外,它保持領先地位並分為兩個亞克隆(Stellingwerf,2017年)。 最後,在2016年,注意到36-2年首次記錄的新基因型37_A2和2013_A2014的出現頻率增加; 迄今為止,這些基因型存在於荷蘭和比利時,部分存在於法國和德國以及英國南部(Cooke,2017)。 每年約有20-30%的西歐人口具有獨特的基因型。
與西歐不同,到13_A2基因型出現時,北歐(瑞典,挪威,丹麥,芬蘭)的人口並不以克隆係為代表,而是以大量獨特的基因型代表(Brurberg等,
2011)。 在西歐的13_A2活躍傳播時期,直到2011年才在北歐北部發現這種基因型,當時它首先在北日德蘭半島(丹麥)被發現,那裡主要生產工業馬鈴薯品種,並積極使用含甲霜靈的玉米。殺菌劑(Nielsen et al。,2014)。 根據www.euroblight.net的數據,13年在挪威和丹麥的數個樣本中以及2年在挪威的數個樣本中也檢測到了2014_A2016基因型。 此外,2013年,芬蘭發現了少量的6_A1基因型。 征服斯堪的納維亞半島的13_A2和其他克隆系失敗的主要原因被認為是該地區與西歐國家的氣候差異。
除了涼爽的夏季和寒冷的冬季有助於卵菌而不是營養菌絲體的生存(Sjöholmet al。,2013),冬季的土壤凍結(通常在西歐較溫暖的國家很少發生)有助於卵菌的萌發和種植同步化。馬鈴薯,增強了它們作為原發感染源的作用(Brurberg等,2011)。 還應注意,在北部條件下,由卵子引起的感染的發展超過了結節性感染的發展,這最終阻止了更具侵略性但後來發展的克隆系的統治(Yuen,2012)。 東歐(波蘭,波羅的海國家)對疫病菌的研究最多,其結構與斯堪的納維亞半島非常相似。
兩種交配類型也都存在於此,通過SSR分析確定的絕大多數基因型是獨特的(Chmielarz等,2014; Runno-Paurson等,2016)。 像在北歐一樣,克隆系(主要是13_A2基因型)的分佈實際上並不影響病原體的本地種群,在沒有明顯的顯性系的情況下,病原體保持了較高的多樣性。
在商業化馬鈴薯品種的田間偶爾觀察到13_A2的存在。 在俄羅斯,情況正在以類似的方式發展。 2008-2011年收集的致病疫黴菌的微衛星分析在俄羅斯歐洲部分的10個不同地區,顯示出高度的基因型多樣性,並且完全缺乏與歐洲克隆系的重合(Statsyuk等,2014)。 幾年後,2013年至2014年在列寧格勒地區收集的疫黴菌樣本研究表明,它們與先前研究中鑑定出的該地區基因型之間存在顯著差異。 在兩項研究中均未發現西歐基因型(Beketova等,2014; Kuznetsova等,2016)。
東歐無疫桿菌種群的高度遺傳多樣性以及其中缺乏優勢克隆係可能與多種原因有關。 首先,與北歐一樣,所考慮的國家的氣候條件也導致卵孢子的形成是主要的感染源(Ulanova等,2010; Chmielarz等,2014)。 其次,這些國家生產的馬鈴薯中有很大一部分是在小型私人農場上種植的,這些農場通常被森林或其他阻礙傳染物質自由流動的障礙所包圍(Chmielarz等,2014)。 通常,在這種條件下種植的馬鈴薯實際上不經過化學處理,品種的選擇基於其晚疫病抗性,即對甲霜靈的侵略性和抗藥性沒有選擇壓力,剝奪了抗性基因型(例如13_A2)優於其他基因型的優勢(Chmielarz等人,2014)。 最後,由於土地面積小,其所有者通常不進行輪作,在同一地方種植馬鈴薯多年,這有助於遺傳多樣性接種物的積累(Runno-Paurson等人,2016; Elansky,2015; Elansky等人。 。,2015)。
亞洲
直到最近,對亞洲疫黴菌的種群結構仍知之甚少。 已知它主要由克隆系代表,並且性重組對新基因型出現的影響很小。 因此,例如在1997-1998年。 在俄羅斯的亞洲部分(西伯利亞和遠東地區),病原體種群僅以三種基因型為代表,其中SIB-1基因型占優勢(Elansky等,2001)。 在中國,日本,韓國,菲律賓和台灣等國家已經顯示出克隆病原體系的存在(Koh等,1994; Chen等,2009)。 在1年代後期-90年代初期,US-2000克隆系在亞洲大部分地區占主導地位。 幾乎所有地方都開始被其他基因型所取代,而其他基因型又被新的基因型所取代。 在大多數情況下,亞洲國家人口結構和組成的變化與新基因型從外部的遷徙有關。 因此,在日本,除了JP-3基因型外,在US-1之後出現的所有其他日本基因型(JP-1,JP-2,JP-3)或多或少地被證明具有外部起源(Akino等,2011)。 ... 目前,中國共有三種主要的病原體種群,它們的地域劃分清晰; 這些人群之間沒有基因流或基因流非常弱(Guo等,2010; Li等,2013b)。 基因型13_A2分別於2005-2007年和2012-1014年在中國南部省份(雲南和四川)出現。 在該國的東北部也可見到(Li等,2013b)。 在印度,13_A2可能與中國同時出現,最有可能是受感染的種薯(Chowdappa等人,2015),以及2009-2010年。 在該國南部造成嚴重的晚疫病附生病,然後蔓延至馬鈴薯,並於2014年在西孟加拉邦爆發了晚疫病,導致許多當地農民破產和自殺(Fry,2016)。
非洲
直到2008-2010 尚未對非洲國家的致病疫黴進行系統的研究。 目前,非洲疫黴菌的非洲種群可分為兩類,這種分化顯然與從歐洲進口種薯的事實有關。
在積極從歐洲進口種薯的北非,A2交配類型在幾乎所有地區都得到廣泛代表,這為通過性重組而出現新基因型提供了理論上的可能性(Corbière等人,2010; Rekad等人,2017)。 此外,在阿爾及利亞,注意到基因型13_A2、2_A1和23_A1的存在,其中第一個顯著佔優勢,並且獨特基因型的比例逐漸減少以完全消失(Rekad et al。,2017)。 與該地區其他地區相反,在突尼斯(該國東北部除外),病原體種群主要由A1交配類型代表(Harbaoui等人,2014)。
克隆系NA-01在這裡占主導地位。 通常,克隆系在人群中的比例僅為43%。 在東部和南部非洲,種子進口量幾乎很少(Fry等,2009),疫病疫黴僅由兩個克隆的A1型品系US-1和KE-1代表,後者積極地將前者取代在馬鈴薯上( Pule等人,2012; Njoroge等人,2016)。 迄今為止,這兩種基因型均具有大量的亞克隆變異。
澳大利亞
在澳大利亞,關於馬鈴薯晚疫病的第一份報告可追溯到1907年,第一批附生病大概是在夏季的大雨造成的,發生於1909-1911年。 (Drenth等,2002)。 但總的來說,晚疫病對該國沒有重大的經濟意義。 由提供高濕度的天氣條件引起的晚疫病偶發性爆發每隔5-7年發生一次的頻率不高,並且主要分佈在塔斯馬尼亞州北部和維多利亞州中部。 鑑於上述情況,實際上缺少專門研究澳大利亞感染性致病菌結構的出版物。 最新的可用信息是從1998-2000。 (Drenth等,2002)。 這組作者說,維多利亞州的人口是美國-1.3的無性系,這間接證實了該基因型從美國的遷徙。 塔斯馬尼亞標本被歸類為AU-3,與當時世界其他地區的基因型不同。
俄羅斯晚疫病發展的特徵
在歐洲,感染是由有病的種子塊莖,在土壤中越冬的卵孢子,以及去年田地(“志願”植物)上過冬的塊莖或經淘汰的塊莖上的過冬塊莖所產生的風引起的游動孢子蟲,被認為是馬鈴薯的主要接種物。存放塊莖的書籤。 其中,生長在廢棄塊莖堆上的植物被認為是最危險的感染源。 在那兒,發芽的塊莖的數量通常很可觀,並且可以長距離攜帶孢子囊。 其餘來源(卵子,“志願”植物)並不那麼危險,因為通常不習慣每隔3-4年在同一田間種植一次植物。 由於良好的種子質量控制系統,患病種子塊莖的感染也極少。
通常,歐洲人口的接種量是有限的,因此流行病的增長相當緩慢,並且可以使用化學殺真菌製劑成功控制。 歐洲條件下的主要任務是在受感染植物中的游動孢子蟲大規模擴散開始的階段,抗擊感染。
在俄羅斯,情況截然不同。 大部分馬鈴薯和番茄作物都在小型私人花園中種植。 要么根本不採取保護措施,要么進行的殺菌處理數量不足,並且要在頂部出現晚疫病之後才開始。 結果,私人菜園成為主要的感染源,風中的游動孢子蟲被帶到商業種植園。 我們在莫斯科,布良斯克,科斯特羅馬和梁贊地區的直接觀察證實了這一點:甚至在開始對商業種植進行殺真菌劑處理之前,就已經觀察到私人花園中的植物遭到破壞。 隨後,大面積流行病被殺真菌劑的使用所限制,而在私家花園中,晚疫病迅速發展。
在對商業種植進行不當或“預算”處理的情況下,晚疫病灶也出現在田間。 後來他們積極發展,覆蓋範圍越來越大(Elansky,2015年)。 私家花園中的感染對商業領域的流行有重大影響。 在俄羅斯所有馬鈴薯種植區中,私人花園中土豆所佔的面積比大型生產者的田地總面積大數倍。 在這種環境下,私人菜園可以被視為商業領域的全球接種物資源。 讓我們嘗試確定私有花園中菌株基因型特徵的那些特性。
對商品馬鈴薯,從可疑的外國生產商那裡獲得的番茄種子進行非種子和檢疫控制,在同一地區長期種植馬鈴薯和西紅柿,不適當的殺真菌劑處理或完全不使用會導致私營部門的嚴重附生,結果是免費的私家花園中的雜交,雜交和卵孢子的形成。 結果,當幾乎每個菌株的基因型都是獨特的時,觀察到了病原體的非常高的基因型多樣性(Elansky等,2001,2015)。 種植具有各種遺傳起源的種薯使得專門針對特定品種的克隆係不太可能出現。 在這種情況下選擇的菌株相對於受影響的品種是通用的,其中大多數具有接近最大數量的毒力基因。 這與農業企業大領域典型的“克隆株系”系統有很大不同,“克隆株系”系統已正確安裝了防止晚疫病的系統。 “克隆系”(當田間所有晚疫病菌株均以一種或幾種基因型表示時)在僅由大型農場進行馬鈴薯種植的國家中無處不在:美國,荷蘭,丹麥等。在英國,愛爾蘭,波蘭等家庭馬鈴薯種植,私家花園也有更高的基因型多樣性。 20世紀末,“克隆系”在俄羅斯的亞洲和遠東地區很普遍(Elansky等,2001),這顯然是由於使用了相同的品種專門種植我們自己生產的馬鈴薯。 最近,這些地區的情況也開始朝著人口基因型多樣性增加的方向變化。
缺乏使用殺真菌劑的強化治療的另一個直接後果是,花園中沒有抗藥性菌株的積累。 實際上,我們的結果表明,在私人花園中發現抗甲霜靈的菌株的頻率明顯低於在商業種植中。
私人花園中典型的馬鈴薯和番茄種植非常接近,有利於這些作物之間的菌株遷移,因此,在最近十年中,從馬鈴薯中分離出的菌株中,攜帶對櫻桃番茄品種(T1)具有抗性的基因的菌株的比例(以前僅具有番茄“菌株。 在大多數情況下,帶有T1基因的菌株對土豆和西紅柿都具有高度的侵害性。
近年來,在許多情況下,晚疫病開始早於馬鈴薯。 番茄幼苗可能在土壤中被卵孢子侵害,或者番茄種子中存在卵孢子或粘附在它們上面(Rubin等,2001)。 在過去的15年中,大量廉價的包裝種子(主要是進口的)已經出現在商店中,並且大多數小型生產商已開始使用它們。 種子可以帶來具有其生長區域典型基因型的菌株。 將來,這些基因型被包括在私家花園的性過程中,這導致了全新基因型的出現。
因此,可以說私人菜園是一個全球性的“熔爐”,通過遺傳材料的交換,加工了現有的基因型,並出現了全新的基因型。 此外,它們的選擇是在與大型農場為馬鈴薯創造的條件非常不同的條件下進行的:沒有殺真菌壓榨,種植品種的均一性,受各種形式的病毒和細菌感染影響的植物占主導地位,接近西紅柿和野生茄屬植物,活躍的雜交和卵孢子形成,可能性讓卵子在明年成為感染源。
所有這些導致了後院種群的非常高的基因型多樣性。 在菜園的附生植物條件下,晚疫病傳播很快,大量孢子被釋放出來,飛到附近的商業種植園。 但是,由於已經進入了具有正確農業技術和化學保護體系的商業領域,因此到達的孢子實際上沒有機會在該領域引發附生植物,這是由於缺乏對殺菌劑具有抗性且專門針對栽培品種的克隆系的緣故。
原發接種物的另一個來源可能是被困在商品苗中的有病塊莖。 這些塊莖通常生長在農業技術優良,化學保護強度高的田地上。 感染塊莖的分離株的基因型適合於其自身品種的發展。 這些菌株對商業種植的危害要比源自私人花園的接種菌更為危險。 我們的研究結果也支持這一假設。 從大田中隔離出來的,經過適當化學保護和良好農業技術的種群在高基因型多樣性方面沒有差異。 通常,這些是一些具有高度侵略性的克隆系。
來自商業種子材料的菌株可以進入菜園中的種群,並參與其中正在進行的過程。 但是,在菜園裡,它們的競爭力將大大低於商業領域,不久它們將不再以克隆系的形式存在,但是它們的基因可以在“花園”人群中使用。
在俄羅斯收割期間,在“志願”植物和大量塊莖上發展的感染與俄羅斯無關,因為在俄羅斯主要的馬鈴薯種植區,觀察到冬季土壤深凍,很少有塊莖在土壤中越冬。 此外,正如我們的實驗所示,晚疫病病原體即使在保留其生存能力的塊莖上也無法在負溫度下存活。 在乾旱地區,種植早馬鈴薯,由於乾燥和炎熱的生長季節,晚疫病很少見。
因此,我們目前正在觀察無疫假單胞菌種群分為“田間”種群和“花園”種群。 然而,近年來,已觀察到導致這些人群的基因型融合和互穿的過程。
其中,可以注意到小型生產者的素養普遍提高,價格實惠的小包裝種薯的出現,殺真菌劑在小包裝中的傳播,以及人們對“化學”的恐懼的減少。
當由於一個供應商的積極活動,整個村莊都種植了相同品種的塊莖,並提供了小包裝的相同農藥的情況出現。 可以假設在附近的商業種植園中會發現相同品種的馬鈴薯。
另一方面,一些農藥貿易公司正在推廣“預算”化學處理方案。 在這種情況下,推薦的治療方法的數量被低估了,並且提供了最便宜的殺真菌劑,其重點不是為了防止晚疫病的發展直至割草,而是為了增加產量而在附生上一定的延遲。 當使用低等級種子材料種植商品馬鈴薯時,從原理上講,沒有問題要獲得高產量時,這種方案在經濟上是合理的。 然而,在這種情況下,與花園種群相反,馬鈴薯遺傳背景的水平有助於選擇特定的生理小種,這對於該品種非常危險。
一般來說,馬鈴薯生產的“花園”和“田間”方法趨於融合的趨勢在我們看來似乎很危險。 為了防止其在家庭和商業領域的負面影響,有必要控制種薯的種類和以小包裝形式提供給私人所有人的殺真菌劑的範圍,以及追踪馬鈴薯保護計劃和在商業領域使用殺真菌劑。
在私營部門的地區,不僅晚疫病而且交鏈孢菌也有密集的發展。 大多數私人農場的所有者沒有採取特殊措施來預防交鏈孢黴,將交鏈孢霉的發育誤認為是葉子的自然枯萎或晚疫病的發展。 因此,隨著對易感品種的鍊格孢菌的大規模開發,家庭土地可作為商業種植的接種源。
變異機制
變異過程
由於突變的發生是一個頻率較低的隨機過程,因此在任何位點發生的突變都取決於該位點的突變頻率和種群數量。 當研究致病疫黴菌株的突變頻率時,通常確定在用化學或物理誘變劑處理後在選擇性營養培養基上生長的菌落數。 從表8中的數據可以看出,同一菌株在不同位點的突變頻率可以相差幾個數量級。 對甲霜靈的抗性突變的高頻率可能是自然界中對其產生抗性的菌株積累的原因之一。
根據實驗室實驗,自發或誘發突變的頻率並不總是與自然種群中發生的過程相對應,原因如下:
1.在異步核裂變中,不可能估計每一核一代的突變頻率。 因此,大多數實驗僅直接提供有關突變頻率的信息,而沒有區分兩個突變事件和有絲分裂後的一個事件。
2.單步突變通常會降低基因組的平衡,因此,隨著新特性的獲得,生物體的總體適應性也會降低。 通過實驗獲得的大多數突變具有降低的攻擊性,並且未在自然種群中記錄。 因此,致病疫黴突變體對苯酰胺類殺菌劑的抵抗程度與在人工培養基上的生長速率之間的相關係數平均為(-0,62),而對馬鈴薯葉片對殺菌劑的抵抗性和侵略性則為(-0,65)(Derevyagina et al。 ,1993),表明突變體的適應性低。 對甲嗎啉抗性的突變還伴隨著生存能力的急劇下降(Bagirova等,2001)。
3.大多數自發和誘發突變是隱性的,在實驗中並不表現出表型,而是在自然種群中構成了隱藏的可變性儲備。 在實驗室實驗中分離出的突變株帶有顯性或半顯性突變(Kulish and Dyakov,1979)。 顯然,核二倍體解釋了在紫外線輻射的影響下獲得突變體的不成功嘗試,這些突變體對先前具有抗性的品種具有毒性(McKee,1969)。 根據作者的計算,此類突變的發生頻率可能小於1:500000。 隱性突變向純合表型表達狀態的轉變可能是由於有性或無性重組引起的(見下文)。 但是,即使在這種情況下,該突變也可以被野生型(多核)菌絲體中的核的優勢等位基因掩蓋,並且僅在單核游動孢子形成過程中表型固定。
表8.在亞硝基甲基脲的作用下,致病疫黴突變為生長抑制物質的頻率(Dolgova,Dyakov,1986; Bagriova等,2001)
連接 | 變異頻率 |
土黴素 | 6,9 10 x-8 |
彈力蛋白S | 7,2 10點¯x-8 |
鏈黴素 | 8,3 x10-8 |
毛黴素 | 1,8 10 x-8 |
環己酰亞胺 | 2,1 10 x-8 |
達科尼爾 | <4 x 10-8 |
二甲嗎啡 | 6,3 10 x-7 |
甲霜靈 | 6,9 10 x-6 |
人口規模在自發突變的發生中也起著決定性的作用。 在非常大的種群中,其中細胞數N> 1 / a,其中a是突變率,突變不再是隨機現象(Kvitko,1974)。
計算表明,平均侵染馬鈴薯田地(每株植物有35個斑點),每天在一公頃土地上形成8x1012孢子(Dyakov和Suprun,1984)。 顯然,這些種群包含每個位點交換類型所允許的所有突變。 即使是罕見的突變,其發生頻率為10-9,也將被居住在一公頃馬鈴薯田的數百萬人口中的一千個個體所捕獲。 對於以較高頻率(例如10-6)發生的突變,在此類種群中,每天(在兩個基因座上同時發生)會發生各種配對突變。 突變過程將取代重組。
移居
對於致病疫黴,兩種主要的遷徙類型是已知的:通過氣流或雨水噴霧傳播游動孢子蟲來關閉距離(在馬鈴薯田或鄰近田地內),以及通過種植塊莖或運輸番茄果實到遠距離。 第一種方法可以擴大疾病的範圍,第二種方法可以在遠離原發灶的地方創建新病灶。
番茄塊莖和水果的感染傳播不僅導致該病在新地方的出現,而且還是人口遺傳多樣性的主要來源。 在莫斯科地區,從俄羅斯和西歐的不同地區種植馬鈴薯。 番茄果實來自俄羅斯的南部地區(阿斯特拉罕地區,克拉斯諾達爾地區,北高加索地區)。 番茄種子也可以作為感染源(Rubin等,2001),也從俄羅斯,中國,歐洲國家和其他國家的南部地區進口。
根據E. Mayr(1974)的計算,由突變引起的局部種群的遺傳變化每個位點很少超過10-5,而在開放種群中,由於基因逆向流動引起的交換至少為10-3-10-4。
感染塊莖的遷徙導致致病疫黴進入歐洲,並蔓延到種植馬鈴薯的世界所有地區。 他們造成了最嚴重的人口變化。 對馬鈴薯的晚疫病幾乎與它在西歐的出現同時出現在俄羅斯帝國的領土上。
自從該病於1846年至1847年在波羅的海國家首次發現,並僅在隨後的幾年中蔓延到白俄羅斯和俄羅斯的西北地區,其西歐血統才顯而易見。 舊世界晚疫病的第一個來源並不那麼明顯。 Fry et al。(Fry et al。,1992; Fry,Goodwin,1995,Goodwin et al。,1994)提出的假設表明,該寄生蟲首先從墨西哥來到北美,然後在整個作物上傳播,然後被運到西歐。 (圖7)。
由於反复漂泊(“瓶頸”的雙重影響),單個克隆進入了歐洲,其後代在整個馬鈴薯種植的舊大陸整個地區引起了大流行。 作為該假設的證據,作者首先引用了一種類型的交配(A1)的普遍性,其次引用了來自不同地區的研究菌株的基因型的同質性(它們均基於分子標記,包括2個同工酶基因座,DNA指紋圖譜和線粒體DNA的結構是相同的,並且對應於美國描述的克隆US-1。 但是,一些數據引起了對所述假設的至少某些規定的懷疑。 從40年代的第一個附生期感染的標本集馬鈴薯樣品中分離的致病疫黴線粒體DNA的分析表明,它們與克隆US-1的線粒體DNA結構不同,因此至少是US-2001。並非歐洲唯一的感染源(Ristaino等,XNUMX)。
80世紀XNUMX年代後期,疫情再次惡化。 發生了以下更改:
1)人口的平均侵略性有所提高,尤其導致了最有害形式的晚疫病的廣泛傳播-對葉柄和莖的損害。
2)馬鈴薯晚疫病的時間有所變化-從XNUMX月下旬到XNUMX月初,甚至到XNUMX月底。
3)以前在舊世界中不存在的A2交配類型已經無處不在。
發生變化之前發生了兩件大事:大量使用新型殺菌劑甲霜靈(Schwinn和Staub,1980年)和墨西哥崛起為世界馬鈴薯出口國(Niederhauser,1993年)。 據此,提出了引起種群變化的兩個原因:在甲霜靈的影響下交配型的轉化(Ko,1994)和從墨西哥引進帶有受感染的塊莖的新菌株(Fry and Goodwin,1995)。 儘管不僅在Ko的影響下,而且在莫斯科國立大學的實驗室中進行的工作(在Savenkova,Chherepennicova-Anikina,2002年)中,都獲得了甲霜靈影響下交配類型的相互轉化,但第二個假設是可取的。 隨著第二種交配方式的出現,俄羅斯感染病原菌菌株的基因型發生了重大變化,包括中性基因(同工酶和RFLP基因座)以及線粒體DNA的結構發生了重大變化。 這些變化的複雜性不能通過甲霜靈的作用來解釋;相反,從墨西哥大量進口新菌株,這些新菌株更具侵略性(Kato et al。,1997),取代了舊菌株(US-1),在種群中占主導地位。 歐洲人口組成的變化發生在很短的時間內-從1980年到1985年(Fry等,1992)。 在前蘇聯的領土上,1985年在愛沙尼亞的收藏物中發現了“新毒株”,比波蘭和德國早(Goodwin等,1994)。 俄羅斯上次在1年從莫斯科地區一個受感染的番茄中分離出“舊菌株US-1993”(Dolgova等,1997)。 同樣在法國,直到90年代初,即在馬鈴薯上早已消失的番茄種植中,才發現“老”菌株(Leberton和Andrivon,1998年)。 P. infestans菌株的變化影響了許多特性,包括極具實踐意義的特性,並增加了晚疫病的危害。
性重組
為了使性重組有助於變異,首先,必須以接近1:1的比例在種群中存在兩種交配方式,其次是初始種群變異性。
不同種群甚至一個種群在不同年份的交配類型比率差異很大(表9,10、90)。 人口中交配類型發生如此劇烈變化的原因尚不清楚(例如,上世紀2002年代初在俄羅斯或以色列),但據信這是由於引入了更具競爭性的克隆(Cohen,XNUMX)。
一些間接數據表明在某些年份和某些地區性過程的過程:
1)對莫斯科地區人群的研究表明,在13個A2交配類型的份額低於10%的人群中,三個同工酶基因座的總遺傳多樣性為0,08,在14個A2份額超過的人群中30%的遺傳多樣性是後者的兩倍(0,15)(Elansky等,1999)。 因此,性交的可能性越高,人口的遺傳多樣性就越大。
2)在以色列(Cohen等,1997)和荷蘭觀察到種群中交配類型的比率與卵孢子形成強度之間的關係。
(Flier等,2004)。 我們的研究表明,在具有A2交配類型的分離株分別佔62%,17%,9%和6%的種群中,分別在78%,50%,30%和15%的分析馬鈴薯葉(具有2個或更多斑點)中發現了卵孢子。
具有2個或更多斑點的樣品比具有1個斑點的樣品(分別為樣品的32%和14%)更有可能含有卵孢子(Apryshko等,2004)。
卵形孢子在馬鈴薯植株的中下部葉片中更為常見(Mytsa等,2015; Elansky等,2016)。
3)在某些地區,已發現獨特的基因型,其發生與性重組有關。 因此,在1989年的波蘭和1990年的法國,葡萄糖6-
磷酸異構酶(GPI 90/90)。 由於以前只有10/90雜合子存在100年,因此純合性歸因於性重組(Sujkowski等,1994)。 在哥倫比亞(美國),常見的是將A2與GPI 100/110和A1與GPI 100/100結合的分離株很常見,但是在1994季節結束時(16月9日和1月100日),菌株具有重組基因型(A110 GPI 2/100和A100 GPI 1997/XNUMX)(Miller等,XNUMX)。
4)在波蘭(Sujkowski等,1994)和北高加索地區(Amatkhanova等,2004)的一些種群中,指紋DNA基因座和同工酶蛋白基因座的分佈與Hardy-Weinberg分佈相對應,這表明
關於性重組對人口變異性貢獻的高份額。 在俄羅斯其他地區,沒有發現與哈代-溫伯格人口分佈相對應的信息,但是顯示了連鎖不平衡的存在,表明克隆繁殖的優勢(Elansky等,1999)。
5)具有不同交配類型(A1和A2)的菌株之間的遺傳多樣性(GST)低於不同種群之間的遺傳多樣性(Sujkowski等,1994),這間接表明存在性雜交。
同時,性重組對人口多樣性的貢獻不能很高。 該貢獻是針對莫斯科地區的人口計算的(Elansky等,1999)。 根據Lewontin(1979)的計算,``重組可以從兩個基因座產生頻率不超過其雜合子乘積的新變體,只有當兩個等位基因的雜合子值已經很高時,重組才有效。
兩種配對類型的比率(對於莫斯科地區而言典型)等於4:1,重組頻率將為0,25。 在研究群體中,三個研究同工酶基因座中有兩個雜交菌株成為雜合子的可能性為0,01(2個菌株中有177個)。 因此,重組產生雙雜合子的概率不應超過其乘積乘以交叉的概率(0,25x0,02x0,02)= 10-4,即。 有性重組體通常不屬於所研究的菌株樣本。 這些計算是針對具有較大變異性的莫斯科地區人口進行的。 在像西伯利亞這樣的單態種群中,性過程,即使它發生在單獨的種群中,也不能影響其遺傳多樣性。
另外,致病疫霉的特徵在於減數分裂中頻繁的染色體錯位,其導致非整倍性(Carter等,1999)。 這種侵犯降低了雜交種的繁殖力。
副性重組,有絲分裂基因轉化
在對帶有不同生長抑製劑抗性突變的致病疫黴菌株進行剪接的實驗中,發現了對這兩種抑製劑均具有抗性的雜酚油的出現(Shattock和Shaw,1975; Dyakov,Kuzovnikova,1974; Kulish,Dyakov,
1979)。 由於菌絲體的異核生物作用,產生了對兩種生長抑製劑具有抗性的菌株,在這種情況下,它們在繁殖過程中被單核游動孢子裂解(Judelson,Ge Yang,1998),或者在單孢子後代中不裂解,因為它們具有四倍體(因為最初的分離物是二倍體)核(K)。 (1979年)。 由於單倍體化,染色體不分離和有絲分裂交叉,雜合二倍體以非常低的頻率分離(Poedinok等,1982)。 通過對雜合二倍體的某些作用(例如,發芽孢子的紫外線照射),可以增加這些過程的頻率。
儘管具有雙重抗性的營養雜種的形成不僅發生在體外,而且還發生在被突變體混合物感染的馬鈴薯塊莖中(Kulish et al。,1978),但是很難評估無性生殖重組在種群中產生新基因型的作用。 由於單倍體化,染色體不分離和有絲分裂穿越而沒有特殊影響的分離子形成的頻率可以忽略不計(小於10-3)。
雜合菌株純合子分離子的出現可能是基於有絲分裂交叉和有絲分裂基因轉換,在大豆疫黴中每個位點的發生頻率為3 x 10-2至5 x 10-5,具體取決於菌株(Chamnanpunt等人。 ,2001)。
儘管發現雜核和雜合二倍體的發生頻率出乎意料的高(達到百分之幾十),但僅當從相同菌株獲得的突變培養物被剪接時才會發生此過程。 當使用從自然界中分離出的不同菌株時,由於營養不相容的存在,不會發生(或發生頻率很低)異核化(Poedinok和Dyakov,1981; Anikina等,1997b; Cherepennikova-Anikina等,2002)。 因此,只能將雜性重組的作用降低為雜合核中的克隆內重組,並且將單個基因過渡到無性過程的純合狀態。 在具有隱性或半顯性殺菌劑抗性突變的菌株中,此過程可能具有流行病學意義。 由於雙性戀過程,其轉變為純合狀態將增加突變攜帶者的抗性(Dolgova,Dyakov,1986)。
基因滲入
雜藻疫黴能夠與雜種卵孢子雜交(見Vorob'eva和Gridnev,1983; Sansome等,1991; Veld等,1998)。 這兩種疫黴菌的天然雜種極具侵略性,以致殺死了英國成千上萬的al木(Brasier等,1999)。 致病疫黴可與普通屬植物和土壤中的其他物種(紅桿菌,煙草,仙人掌等)一起發生,但文獻中關於種間雜種可能性的信息很少。 在實驗室條件下,獲得了致病疫黴和美麗紫銹病之間的雜種(Goodwin and Fry,1994)。
表9. 2年至1990年期間,世界不同國家的A2000交配型致病疫霉的比例(根據公開文獻來源和網站www.euroblight.net,www.eucablight.org的數據)
國家 | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
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白俄羅斯 | 33(12) | 34(29) | |||||||||
比利時 | 15(49 *) | 6(66) | 20(86) | ||||||||
厄瓜多爾 | 0(13) | 0(12) | 0(19) | 0(21) | 12(41) | 25(39) | 15(75) | 22(73) | 25(68) | 0(35) | |
愛沙尼亞 | 8(12) | ||||||||||
英格蘭 | 4(26) | 3(630) | 9(336) | ||||||||
芬蘭 | 0(15) | 19(117) | 12(16) | 21(447) | 6(509) | 9(432) | 43(550) | ||||
法國 | 0(35) | 0(56) | 0(83) | 0(67) | 0(86) | 2(135) | 7(156) | 6(123) | 0(73) | 0(285) | 0(135) |
匈牙利 | 72(32) | ||||||||||
愛爾蘭 | 4(145) | ||||||||||
北。 愛爾蘭 | 10(41) | 9(58) | 1(106) | 0(185) | 0(18) | 0(56) | 0(35) | 0(26) | |||
荷蘭 | 7(41) | 5(276) | 24(377) | 44(353) | 23(185) | ||||||
挪威 | 25(446) | 28(156) | 8(39) | 18(257) | 38(197) | ||||||
秘魯 | 0(34,1984 -86) | 0(287,1997-98) | 0(112) | 0(66) | |||||||
波蘭 | 19(180) | 21(142) | 33(256) | 26(149) | 35(70) | ||||||
蘇格蘭 | 25(147) | 11(163) | 22(189) | 5(22) | |||||||
瑞典 | 25(263) | 62(258) | 49(163) | ||||||||
威爾士 | 0(16) | 7(97) | 0(48) | 0(25) | |||||||
韓國 | 36(42) | 10(130) | 15(98) | ||||||||
中國 | 20(142,1995-98) | 0(6) | 0(8) | 0(35) | |||||||
哥倫比亞 | 0(40,1994-2000) | ||||||||||
烏拉圭 | 100(25,1998-99) | ||||||||||
摩洛哥 | 60(108,1997-2000) | 52(25) | 42(40) | ||||||||
Сербия | 76(37) | ||||||||||
墨西哥 (托盧卡) | 28(292,1988-89) | 50(389,1997-98) |
表10. 2年至2000年期間世界不同國家中A2011交配型致病疫霉的比例
國家 | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
奧地利 | 65(83) | ||||||||||
白俄羅斯 | 42(78) | ||||||||||
比利時 | 20(102 *) | 4(32) | 50(14) | 25(16) | 62(13) | 54(26) | 70(54) | 30(23) | 29(35) | 62(71) | 45(49) |
瑞士 | 89(19) | ||||||||||
捷克共和國 | 35(31) | 54(64) | 38(174) | 12(80) | |||||||
德國 | 95(53) | ||||||||||
丹麥 | 48(52) | ||||||||||
厄瓜多爾 | 5(178) | 6(108) | 9(121) | 18(94) | 2(44) | 0(66) | 5(47) | ||||
愛沙尼亞 | 54(25) | 0(24) | 33(62) | 45(140) | 25(100) | 12(103) | |||||
英格蘭 | 4(47) | 10(96) | 31(55) | 55(790) | 68(862) | 70(552) | 68(299) | ||||
芬蘭 | 47(162) | 12(218) | 42 | ||||||||
法國 | 0(186) | 4(108) | 8(61) | 22(103) | 33(303) | 65(378) | 74(331) | 75(125) | 75(12) | ||
匈牙利 | 48(27) | 48(90) | 9 | 7 | |||||||
北。 愛爾蘭 | 0(38) | 0(58) | 0(40) | 0(24) | 5(54) | 0(18) | 27(578) | 45(239) | 36(213) | 82(60) | 10(80) |
荷蘭 | 66(24) | 93(15) | 91(11) | ||||||||
挪威 | 39(328) | 3(115) | 12(19) | ||||||||
秘魯 | 0(36) | ||||||||||
波蘭 | 25(46) | 10(30) | 85(20) | 38(44) | 75(66) | 55(56) | 65(35) | 72(81) | 85(21) | ||
蘇格蘭 | 3(213) | 2(474) | 24(135) | 86(337) | 88(386) | 74(172) | |||||
瑞典 | 60(277) | 39(87) | |||||||||
斯洛伐克 | 0(36) | 14(26) | 62(26) | 0(26) | |||||||
威爾士 | 25(12) | 68(106) | 80(88) | 92(143) | 75(45) | ||||||
韓國 | 46(26) | ||||||||||
巴西 | 0(49) | 0(30) | |||||||||
中國 | 10(30) | 0(6) | 0(6) | ||||||||
越南 | 0(294,2003-04) | ||||||||||
烏干達 | 0(8) |
人口基因型組成的動態
在其他地區新克隆的遷徙,農業實踐(品種的變化,殺真菌劑的應用)和天氣條件的影響下,感染晚疫病菌的基因型組成可能發生變化。 外部影響在生命週期的不同階段對克隆的影響不同;因此,由於基因漂移和選擇的主導作用發生了變化,種群每年經歷選擇基因的頻率週期性變化。
品種的影響
具有垂直抗性有效基因的新品種(R基因)是一個強大的選擇因子,可在致病疫黴種群中選擇具有互補毒力基因的克隆。 在馬鈴薯品種中不存在抑制病原體種群生長的非特異性抗性的情況下,替換種群中優勢克隆的過程非常迅速。 因此,在具有R3抗性基因的多莫傑多夫斯基品種在莫斯科地區傳播之後,對該品種有毒力的克隆的頻率在一年內從0,2增加到0,82(Dyakov,Derevjagina,2000)。
但是,種群中毒力基因(致病型)頻率的變化不僅發生在栽培馬鈴薯品種的影響下。 例如,在白俄羅斯,直到1977年,毒力基因1和4的克隆占主導地位,這是由種植具有抗性基因R1和R4的馬鈴薯品種引起的(Dorozhkin,Belskaya,1979)。 然而,在70世紀2002年代末,出現了具有不同毒力基因及其組合的克隆,並且互補抗性基因從未在馬鈴薯育種中使用(額外毒力基因)(Ivanyuk等,XNUMX)。 出現這種克隆的原因顯然是由於馬鈴薯塊莖將傳染性物質從墨西哥遷移到歐洲。 在他們的家鄉,這些克隆不僅在栽培的馬鈴薯上生長,而且在帶有多種抗性基因的野生物種上發育;因此,基因組中許多毒力基因的結合對於在這些條件下生存是必需的。
至於具有非特異性抗性的品種,它們通過降低病原體的繁殖速度來延緩其種群的進化,正如已經提到的,這是數量的函數。 由於侵略性是多基因的,因此包含更多用於“侵略性”的基因的克隆積累的越快,種群規模越大。 因此,高侵略性種族不是適應具有非特異性抗性的栽培品種的產物,相反,在寄生蟲孢子積累的高度易感品種的種植中更有可能被發現。
因此,在俄羅斯,一年生附生區(薩哈林州,列寧格勒州和布良斯克州的人口)發現了侵染性最強的疫黴菌種群。 事實證明,這些人口的侵略性高於墨西哥人(Filippov等,2004)。
此外,與易感品種相比,在抗性品種的葉片中形成的卵孢子更少(Hanson和Shattock,1998),也就是說,該品種的非特異性抗性也降低了寄生蟲的重組能力和替代性越冬方法的可能性。
殺菌劑的影響
殺菌劑不僅減少了植物致病真菌的數量,即影響其種群的數量特徵,但它們也可以改變單個基因型的頻率,即影響人口的定性構成。 人口在殺真菌劑影響下變化的最重要指標包括:對殺真菌劑的抗性變化,侵略性和毒力的變化以及生殖系統的變化。
殺菌劑對種群抗性和侵略性的影響
這種影響的程度首先取決於所使用的殺菌劑的類型,可以有條件地將其分為多部位,低部位和單部位。
前者包括大多數接觸殺菌劑。 對它們的抗性(如果可能的話)由大量非常弱表達的基因控制。 這些性質決定了用殺真菌劑處理後種群抗性沒有明顯變化(儘管在某些實驗中獲得了一些抗性的增加)。 噴灑接觸性殺菌劑後保存的真菌種群由兩組菌株組成:
1)菌株保存在未經藥物處理的植物區域。 由於沒有與殺菌劑接觸,因此這些菌株的侵略性和耐藥性不會改變。
2)與殺菌劑接觸的菌株,其接觸點的濃度低於致死性。 如上所述,這部分人群的抵抗力也沒有改變,但是由於殺真菌劑的部分破壞作用,即使在致死濃度下對真菌細胞的代謝,總體適應性及其寄生成分,侵略性也有所降低(Derevyagina and Dyakov,1990)。
因此,即使是尚未死亡的一部分人口,暴露於與殺真菌劑的接觸下,攻擊力也很弱,不能成為附生植物的來源。 因此,謹慎的處理(減少不與殺真菌劑接觸的人群比例的頻率)是成功採取保護措施的條件。 對寡聚體殺真菌劑的抗性由幾個加性基因控制。
每個基因的突變都會導致耐藥性的增加,而總體耐藥性則歸因於此類突變的添加。 因此,電阻的增加是逐步發生的。 抗性逐步增加的一個例子是對殺真菌劑二甲基嗎啡的抗性突變,其廣泛用於保護馬鈴薯免於晚疫病。 耐甲嗎啉是多基因的和加性的。 一步突變會稍微增加抵抗力。
每個後續突變都會降低目標大小,從而降低後續突變的頻率(Bagirova等,2001)。 在經過寡聚體殺真菌劑多次處理後,種群的平均抗藥性增加是逐步發生的。 該過程的發生率至少由三個因素決定:抗性基因的突變頻率,抗性係數(抗性菌株的致死劑量與敏感菌株的比值)和抗性基因突變對適應性的影響。
每個後續突變的發生頻率均低於前一個突變;因此,該過程具有阻尼特性(Bagirova等,2001)。 但是,如果群體中發生重組過程(性或同性伴侶),則有可能在雜種菌株中合併不同的親本突變,並加速這一過程。 因此,panmix種群獲得的抵抗力比無菌種群更快,而在後者中,沒有植物性不相容性屏障的種群比除以這些屏障的種群更快。 在這方面,在交配類型不同的種群中存在菌株會加速獲得對寡聚體殺真菌劑的抗性的過程。
第二和第三因素對人群中耐甲氧嗎啡菌株的迅速積累沒有貢獻。 每個隨後的突變使抗性幾乎加倍,這是微不足道的,同時降低了人工環境中的生長速率和侵略性(Bagirova等,2001; Stem,Kirk,2004)。 也許這就是為什麼在天然疫黴菌中幾乎沒有抗性菌株的原因,即使是從用二甲嗎啡處理過的馬鈴薯種植中收集到的也沒有。
用寡聚體殺真菌劑治療的人群還將包括兩組菌株:那些尚未與殺真菌劑接觸並因此未改變其原始特性的菌株(如果這一組中有抗藥性菌株,由於敏感菌株的較高侵略性和競爭力,它們將不會積累),與致死濃度以下的殺菌劑接觸的菌株。 在後者之中,抗性菌株的積累是可能的,因為在這裡它們比敏感菌株更具優勢。
因此,當使用低聚殺菌劑時,作為高濃度藥物(比致死劑量高幾倍),不重要的是徹底的治療,因為在逐步誘變中,突變菌株的初始耐藥性較低。
最後,對單部位殺真菌劑的抗性突變具有很高的表達力,即一個突變可以報告高水平的抗性,直至完全喪失敏感性。 因此,種群抵抗力的增加非常迅速地發生。
這種殺真菌劑的例子是苯酰胺,包括最常見的殺真菌劑甲霜靈。 對它的抗性突變以高頻率發生,並且突變體中的抗性程度很高-它超過敏感菌株一千倍以上(Derevyagina et al。,1993)。 儘管抗性突變體的生長速率和侵襲性在系統性殺菌劑導致易感菌株死亡的背景下降低,但抗性種群的數量卻在迅速增長,其侵略性也在平行增長。 因此,在使用殺真菌劑幾年之後,抗藥性菌株的侵略性不僅可以等同於敏感菌株的侵略性,而且還可以超過它(Derevyagina,Dyakov,1992)。
對性重組的影響
由於在致病疫黴種群中A2交配類型的頻繁發生與甲霜靈對抗晚疫病的大量使用相吻合,因此可以認為甲霜靈誘導了交配類型的轉化。 在寄生性瘧原蟲中,在氯丁烯和甲霜靈的作用下這種轉化被實驗證明(Ko,1994)。 在甲霜靈濃度低的培養基上單次通過導致出現了對對甲霜靈敏感的,具有A1交配型的致病疫霉的同型分離株的出現(Savenkova和Cherepnikova-Anikina,2002年)。 在具有較高甲霜靈濃度的培養基上進行後續傳代過程中,未檢測到A2配對類型的單個分離株,但是,大多數分離株與A2分離株而不是卵孢子雜交時,會形成難看的菌絲體積聚並且是無菌的。 在甲霜靈濃度高的培養基上具有A2交配型的抗性菌株的傳代使我們能夠檢測到三種形式的交配型變化:1)與A1和A2分離株雜交時完全無菌。 2)同種異教(單培養中卵孢子的形成); 3)將A2配對類型轉換為A1。 因此,甲霜靈會導致感染晚疫病菌種群的交配類型發生變化,從而導致它們發生有性重組。
對營養重組的影響
一些對抗生素具有抗性的基因增加了菌絲異核和核二倍體化的頻率(Poedinok和Dyakov,1981)。 如前所述,由於這種真菌的營養不相容現象,很少有不同疫黴菌融合過程中菌絲的異核轉化。 但是,對某些抗生素具有抗性的基因可能會產生副作用,以克服植物不相容性來表達。 1S-1突變型鏈黴素抗性基因具有此特性。 疫黴菌田間種群中此類突變體的存在可以增加菌株之間的基因流動,並加快整個種群對新品種或殺菌劑的適應性。
某些殺真菌劑和抗生素會影響有絲分裂重組的頻率,這也會改變人群的基因型頻率。 廣泛使用的殺真菌劑苯菌靈與β-微管蛋白結合,後者是一種從中構建細胞骨架微管的蛋白質,從而破壞了有絲分裂後期的染色體分離過程,從而增加了有絲分裂重組的頻率(Hastie,1970)。
用於治療榆樹荷蘭病的殺菌劑對氟苯丙氨酸具有相同的特性。 對氟苯丙氨酸增加了雜合二倍體致病疫黴中重組的頻率(Poedinok等,1982)。
致病疫黴生命週期中種群基因型組成的周期性變化
溫帶地區晚疫病的經典發育週期包括四個階段。
1)世代較短的人口的指數增長階段(多環階段)。 此階段通常在1,5月開始,持續2-XNUMX個月。
2)由於未受影響的組織比例急劇下降或天氣條件不利而停止人口增長的階段。 在農場進行早期收穫前摘葉的這一階段從年度週期中退出。
3)塊莖越冬階段,由於塊莖的意外感染,感染的發展緩慢,沒有塊莖的再次感染,在正常儲存條件下受影響的塊莖的腐爛和撲殺而導致種群數量顯著減少。
4)在土壤和幼苗上緩慢發育的階段(單環階段),其中生成的時間可以達到一個月或更長(XNUMX月下旬至XNUMX月初)。 通常在這個時候,即使有特殊觀察,病葉也很難被發現。
人口指數增長階段(多環階段)
大量觀察結果(Pshedetskaya,Kozubova,1969; Borisenok,1969; Osh,1969; Dyakov,Suprun,1984; Rybakova,Dyakov,1990)表明,在附生開始時,低毒力和侵略性強的克隆占主導地位,隨後被更具毒性和侵略性的克隆取代。種群侵略性的增長速率越高,寄主植物的抗性就越差。
隨著種群的增長,引入商業品種(R1-R4)和選擇性中性(R5-R11)的選擇性重要基因的濃度均增加。 因此,在1993年莫斯科附近的人群中,從8,2月下旬到9,4月中旬的平均毒力從5增加到31,並且觀察到選擇性中性毒力基因R86的最大毒力(毒力克隆的1996%至XNUMX%)(Smirnov,XNUMX年) )。
人口增長率的降低伴隨著人口寄生活性的降低。 因此,在抑鬱期,種族總數和高毒性種族的比例都低於附生種族(Borisenok,1969)。 如果在附生氣候的高峰期條件變得不利於晚疫病並且馬鈴薯侵染減少,那麼高毒力和侵略性克隆的濃度也會降低(Rybakova等,1987)。
影響種群的毒性和侵略性的基因頻率的增加可能是由於在混合種群中選擇了更具毒性和侵略性的克隆。 為了證明這一選擇,開發了一種用於分析中性突變的方法,該方法已成功用於酵母(Adams等,1985)和禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)的化肥種群中(Wiebe等,1995)。
在野外疫霉的田間種群中,對殺稻瘟菌素S具有抗性的突變體的頻率隨著種群侵略性的增長而下降,這表明在種群生長過程中優勢克隆發生了變化(Rybakova等,1987)。
塊莖越冬階段
在馬鈴薯塊莖越冬期間,致病疫黴菌株的毒力和侵襲性降低,並且毒力的降低發生的速度比侵襲性更慢(Rybakova and Dyakov,1990)。 顯然,在有利於種群快速增長(r選擇)的條件下,“額外”毒力基因和高侵略性是有用的,因此附生植物的發展伴隨著對最強毒和侵略性克隆的選擇。 在環境飽和的條件下,當不是繁殖速度而是在不利條件下的持久存在(K選擇)起著重要作用時,毒力和攻擊性的“額外”基因會降低適應性,並且帶有這些基因的克隆會首先消失,因此平均攻擊性和人口的毒性正在下降。
土壤植被階段
這個階段是生命週期中最神秘的階段(Andrivon,1995年)。 它的存在純粹是推測性的-由於缺乏關於病原體在長時間(有時超過一個月)中發生什麼情況的信息-從馬鈴藷苗的出現到疾病初發點的出現。 在觀察和實驗的基礎上,重建了真菌在這一生命週期中的行為(Hirst和Stedman,1960; Boguslavskaya,Filippov,1976)。
真菌的孢子形成可以在土壤中被感染的塊莖上形成。 產生的孢子與菌絲一起發芽,該菌絲可以在土壤中長期生長。 初級(在塊莖上形成)和次級(在土壤中的菌絲體上)孢子通過毛細管電流上升到土壤表面,但是只有在馬鈴薯的下部葉片下降並與土壤表面接觸後才具有感染馬鈴薯的能力。 這樣的葉子(即在其上發現該病的第一點)不是立即形成的,而是在馬鈴薯頂層的長期生長和發育之後形成的。
因此,腐生植被階段也可以存在於晚疫病的生命週期中。 如果在生命週期的寄生階段,侵略性是適應性的最重要組成部分,那麼在腐生階段,選擇的目的是降低寄生特性,如某些植物病原真菌的實驗證明(見Carson,1993)。 因此,在循環的此階段,應最強烈地喪失侵蝕性。 但是到目前為止,還沒有進行直接的實驗來證實上述假設。
季節性變化不僅影響致病疫霉的致病特性,而且還影響其對殺菌劑的抗性,殺菌劑在多環期(附生植物期)生長,在冬季貯藏期間降低(Derevyagina等,1991; Kadish和Cohen,1992)。 在受影響的塊莖的播種與田間疾病首發出現之間,人們對甲霜靈的抗藥性下降特別明顯。
種內專業化及其發展
致病疫黴正在導致兩種重要的商業作物馬鈴薯和番茄的流行。 真菌進入新區域後不久,馬鈴薯的附生開始。 在馬鈴薯受到感染後不久,番茄也被擊敗,但是番茄的附生植物僅在一百年後即在XNUMX世紀中葉就被注意到。 這是Hallegli和Niederhauser寫的關於西紅柿在美國失敗的書
(1962):“在100年發生嚴重附生後約1845年間,很少或幾乎沒有嘗試獲得抗性番茄品種。 儘管早疫病最早於1848年在西紅柿上記錄下來,但直到1946年該病暴發之後,它才成為育種者對該植物認真關注的對象。 在俄羅斯境內,番茄的晚疫病於60世紀被發現。 “很長一段時間以來,研究人員一直沒有註意到這種疾病,因為它不會造成重大的經濟損失。 但是在70年代和1979年代。 在蘇聯,二十世紀末晚疫病對番茄的附生髮生在主要在下伏爾加河地區,烏克蘭,北高加索地區,摩爾多瓦……(Balashova,XNUMX)。
從那時起,晚疫病已成為番茄的一年病,遍及工業和家庭種植的整個領域,並對該作物造成巨大的經濟損失。 發生了什麼? 為什麼寄生蟲在馬鈴薯上的首次出現和這種作物的附生病害幾乎同時發生,為什麼附生菌要花一個世紀才能出現在番茄上? 這些差異支持墨西哥而不是南美的傳染源。 如果疫黴疫黴菌是茄屬茄屬墨西哥塊莖菌種的寄生蟲,那麼可以理解為什麼與該墨西哥人屬屬於同一科的栽培馬鈴薯受到如此強烈的影響,但是由於沒有與該寄生蟲共同進化,因此沒有形成特異性和非特異性抗性的機制。
番茄屬於該屬的另一部分,其交換類型與塊莖類物種有顯著差異,因此,儘管番茄不在疫病疫原的食物特化範圍內,但其破壞強度不足以造成嚴重的經濟損失。
番茄上附生植物的出現是由於寄生蟲發生了嚴重的遺傳變化,從而在寄生期間增加了其適應性(致病性)。 我們認為,專門用於番茄寄生的新形式是M. Gallegly所描述的T1種族,它影響了櫻桃番茄(Red Cherry,渥太華)的品種,對馬鈴薯上普遍存在的T0種族具有抵抗力(Gallegly,1952年)。 顯然,一個突變(或一系列突變)使T0種族變成T1種族,並導致出現了高度適合打敗番茄的克隆。 通常,對一個宿主的致病性增加伴隨著對另一個宿主的致病性降低,也就是說,對馬鈴薯(種族T0)和番茄(種族T1)產生了初始的,尚未完全的種內特異性。
這種假設的證據是什麼?
- 發生在土豆和西紅柿上。 在番茄葉片上,T1族占主導地位,而在馬鈴薯葉片上,則很少見。 根據S.F. Bagirova和T.A. 1991年至1992年在莫斯科地區的Oreshonkova(未出版),T1種族在馬鈴薯種植中的發生率為0%,在番茄種植中為100%; 在1993-1995年-分別為33%和90%; 在2001年-0%和67%。 在以色列也獲得了類似的數據(Cohen,2002)。 用T1分離株以及T0和T1分離株的混合物感染馬鈴薯塊莖的實驗表明,T1分離株在塊莖中的保存較差,並被T0分離株所替代(Dyakov等,1975; Rybakova,1988)。
2)番茄種植中T1種族的動態。 番茄葉片的初次感染是通過T0小種的分離株進行的,這些分離株在葉片上最初斑點的感染分析中占主導地位。 這證實了寄生蟲遷移的普遍接受的方案:馬鈴薯的主要感染群是由T0種族造成的,但是,一旦保存在番茄上,少量保存在馬鈴薯中的T1克隆就會取代T0種族並在附生期結束時積累。 T1種族也可能是番茄葉片感染的另一種來源,它不像馬鈴薯塊莖和葉片那麼強大,但是持續不斷。 因此,該來源對感染番茄的種群的遺傳結構影響不大,但隨後決定了T1族的積累(Rybakova,1988; Dyakov等,1994)。
3)對土豆和西紅柿的攻擊性。 T0和T1族分離株對番茄和馬鈴薯葉片的人工感染表明,前者對馬鈴薯的侵害性強於番茄,而後者對番茄的侵害性強於馬鈴薯。 這些差異表現為在溫室中的葉傳代過程中從混合種群中分離出的非“自己”種族的分離株(D'yakov等,1975)和田間樣地(Leberton等,1999)。 最小感染量,潛伏期,感染點大小和孢子產生的差異(Rybakova,1988; Dyakov等,1994; Legard等,1995; Forbes等,1997; Oyarzun等,1998; Leberton等。等人,1999; Vega-Sanchez等人,2000; Knapova,Gisi,2002; Sussuna等人,2004)。
T1種族分離株對缺乏抗性基因的番茄品種的侵襲性很高,以至於這些分離株在葉子上和在營養培養基上的芽孢都不會破壞被感染的組織(Dyakov等,1975; Vega-Sanchez等,2000)。
4)土豆和西紅柿的毒性。 T1種族影響具有Ph1抗性基因的櫻桃番茄品種,而T0種族無法感染這些品種,即毒力較窄。 關於差異化因素
馬鈴薯的R基因是反向相關的,即從番茄葉片中分離出的菌株比“馬鈴薯”菌株的毒性低(表11)。
5)中性標記。 對寄生在馬鈴薯和西紅柿上的致病疫黴種群中中性標記的分析也證明了多向種內選擇。 在巴西致病疫黴菌種群中,番茄葉分離株屬於克隆系US-1,而馬鈴薯葉分離株屬於BR-1系(Suassuna等人,2004)。 自1994年以來,在美國佛羅里達州,US-90克隆開始在馬鈴薯上占主導地位(發生率超過8%),而在番茄上克隆US-11和US-17,後者的分離株對番茄的侵害性比對馬鈴薯的侵害性(Weingartner ,Tombolato,2004)。 1200年至1989年在美國收集的1995個P. infestans菌株在馬鈴薯和番茄分離株的基因型頻率(DNA指紋圖譜)上存在顯著差異(Deahl等,1995)。
使用AFLP方法可以分離74-1996年從馬鈴薯和番茄葉片中收集的1997個菌株。 在法國和瑞士分成7組。 馬鈴薯和番茄菌株沒有明顯的差異,但是“馬鈴薯”菌株在遺傳上比“番茄”菌株更多樣化。 前者在所有七個簇中均被發現,後者僅在四個簇中被發現,這表明後者的基因組更加專業化(Knapova和Gisi,2002)。
6)隔離機制。 如果兩個寄主植物物種上的寄生蟲種群向其“自己的”寄主專業化發展,那麼各種減數分裂前後的機制就會出現,從而阻止種群間的遺傳交換(Dyakov和Lekomtseva,1984)。
幾項研究已經研究了親本菌株來源對雜交效率的影響。 當雜交從厄瓜多爾茄屬不同物種分離的菌株時(Oliva等,2002),發現野生茄科(克隆品系EC-2)與A2交配型菌株與西紅柿菌株(EC品系)雜交最差。 -3),並且最有效地與馬鈴薯菌株(EC-1)雜交。
發現所有雜種均非致病性。 作者認為雜交率低和雜交體的致病性降低歸因於種群生殖分離的減數分裂後機制。
在Bagirova等人(1998年)的實驗中,大量的馬鈴薯和番茄菌株與T0和T1小種的特性雜交。 從番茄中分離出的T1xT1菌株的繁殖力最高(在顯微鏡視野中為36卵形孢子,佔孢子萌發的44%),效果最差的是從不同宿主分離出的T0xT1菌種的雜交(發育和發芽的卵孢子數量少,流產和未發育的卵子比例高) ... 從馬鈴薯中分離出的T0族分離株之間的雜交效率是中等的。 由於T0族菌株的主體影響馬鈴薯,因此它具有可靠的越冬來源-馬鈴薯塊莖,因此,卵子作為越冬感染單位對馬鈴薯種群的重要性不高。 經過改編的“番茄形式”能夠以卵形孢子的形式在番茄上過冬(見下文),因此保留了較高的有性生產力。 由於其高生育力,T1在番茄中具有獲得原發感染的獨立潛力。 Knapova等人(Knapova等人,2002)獲得的結果可以用相同的方式解釋。 從馬鈴薯中分離出的菌株與番茄中的菌株雜交得到的卵孢子數量最高,為每平方毫米13,8。 中等(散度為5-19)和中等比例的卵孢子萌發(6,3為散度為0-24)。 從番茄分離的菌株雜交產生的卵孢子百分比最低(7,6,傳播4-12),發芽率最高(10,8)。 從馬鈴薯中分離的菌株之間的雜交產生中等數量的卵孢子(8,6,具有很高的數據散佈度(0-30))和最低的卵孢子發芽率(2,7)。 因此,來自馬鈴薯的菌株的繁殖力不及來自番茄的菌株,但是種群間雜交的結果並不比種群內雜交的結果差。 Bagirova等人可能與上述數據存在差異。 可以這樣解釋:俄羅斯研究人員使用的是90世紀90年代初分離出的菌株,瑞士研究人員使用的是XNUMX年代後期分離出的菌株。
低繁殖力的基礎可能是菌株的異倍性。 如果在墨西哥人群中,卵子後代的性過程和原發性感染是正常的,則大多數研究的致病疫黴菌都是二倍體,那麼在舊世界國家中,觀察到倍性的種群內多態性(二倍,三倍和四倍體菌株,以及具有異倍體核的異核菌株)。以及具有不同交配類型的菌株,即相互繁殖,核倍性不同(Therrien等,1989,1990; Whittaker等,1992; Ritch,Daggett,1995)。 花粉和卵原細胞核的多樣性可能是低生育力的原因。
至於在吻合過程中菌絲之間的核交換,可通過營養不相容性來防止,這會將無性種群分解為許多遺傳分離的克隆(Poedinok和Dyakov,1987; Gorbunova等,1989; Anikina等,1997b)。
7)人口趨同。 以上數據表明“馬鈴薯”和“番茄”致病畢赤酵母菌株之間的雜交是可能的。 儘管降低了侵略性,但是也可以相互感染不同的宿主。
1993年對鄰近馬鈴薯和番茄田間分離株的種群標記進行的研究表明,從番茄葉片分離出的分離株中約有四分之一是從鄰近馬鈴薯田轉移的(Dolgova等,1997)。 從理論上講,可以假設兩個宿主上種群的差異會增加,並導致出現特殊的種內形式(馬鈴薯馬鈴薯和番茄番茄),特別是因為卵孢子可以在植物殘骸中持續存在(Drenth等,1995)。 ; Bagirova,Dyakov,1998)和番茄種子(Rubin等,2001)。 因此,西紅柿目前具有獨立於馬鈴薯塊莖的春季再生來源。
但是,一切都不同。 卵孢子越冬使寄生蟲避免了其生命週期中最窄的階段-土壤中植被的單週期階段,在此期間寄生特性降低,並在夏季的多環階段逐漸恢復。
表11.致病疫黴菌株中毒力基因對馬鈴薯分化子品種的頻率
國家 | 年 | 菌株中毒力基因的平均數量 | 作者 | |
從土豆 | 從番茄 | |||
法國 | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton等,1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | 萊伯頓,安德里翁,1998年 | |
法國,瑞士 | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | 吉納·納納波娃,2002年 |
美國 | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin等人,1995年 |
美國,Zap。 華盛頓 | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance等,1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
厄瓜多爾 | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun等,1998 |
以色列 | 1998 | 7 | 4.8 | 科恩,2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
俄羅斯,莫斯科。 地區 | 1993 | 8.9 | 6.7 | 斯米爾諾夫,1996年 |
俄羅斯,不同地區 | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya等。 |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
萌發的卵菌的初級游動孢子蟲和游動孢子具有很高的寄生活性,尤其是如果卵菌是在具有相反交配類型的菌株的信息素的影響下單性發生的。 因此,從被卵孢子感染的種子生長的番茄幼苗上的傳染性物質對於番茄和馬鈴薯都是高度致病的。
這些變化導致了另一個人口結構調整,從流行病學的角度來看,表現為以下重要變化:
- 受感染的番茄幼苗已成為馬鈴薯主要感染的重要來源(Filippov,Ivanyuk,個人信息)。
- 早在XNUMX月就開始觀察到馬鈴薯的附生植物,比平時早了一個月。
- 在馬鈴薯種植中,T1種的百分比增加了,以前在那裡發現的數量微不足道(Ulanova等,2003)。
- 從番茄葉片分離的菌株在致病力基因的馬鈴薯分化子上的致病力不再與馬鈴薯菌株不同,不僅在番茄上而且在馬鈴薯上的侵略性也開始超過“馬鈴薯”菌株(Lavrova等,2003; Ulanova等。 ,2003)。
因此,種群之間趨於一致,而不是發散,而是在兩個寄主植物上出現了單個種群,這些寄主植物對兩個物種都具有高毒力和侵略性。
結論
因此,儘管對致病疫黴進行了150多年的深入研究,但在生物學上,包括栽培茄科植物最重要疾病的致病因子的種群生物學,包括許多生物學領域,仍然未知。 尚不清楚生命週期的各個階段的變化如何影響種群結構,侵略性和毒力的渠道變異性的遺傳機制是什麼,自然種群中生殖和克隆生殖系統的比率是什麼,植物不相容性如何遺傳,馬鈴薯和番茄在這些作物的主要感染中的作用是什麼?它們對寄生蟲的種群結構有什麼影響。 到目前為止,諸如改變寄生蟲侵襲性的遺傳機製或非特異性馬鈴薯抗性的侵蝕等重要的實際問題尚未得到解決。 隨著馬鈴薯晚疫病研究的深入和擴展,該寄生蟲對研究人員提出了新的挑戰。 但是,實驗能力的提高,新的方法對基因和蛋白質進行操作的方法的出現,使我們希望成功解決所提出的問題。
該文章發表在《馬鈴薯保護》雜誌上(3年第2017期)